Summary

A manipulação mecânica de Neurônios para controlar o desenvolvimento Axonal

Published: April 10, 2011
doi:

Summary

Aplicação e medições diretas de forças sobre os neurônios na faixa Microdyne 2000-1000 são obtidos com alta precisão usando agulhas de vidro calibrado. Esta metodologia pode ser usada para controlar e medir vários aspectos do desenvolvimento axonal, incluindo a iniciação axonal, a tensão axonal, a velocidade de alongamento axonal, e vetores de força.

Abstract

Manipulações de células e extensão de axônios neuronal pode ser realizado com vidro calibrado micro-fibras capazes de medir e aplicação de forças na faixa de 1,2 1-10 μdyne. Medidas de força são obtidos através da observação da Hookean flexão das agulhas de vidro, que são calibrados por um método direto e empírica 3. Requisitos de equipamentos e procedimentos para a fabricação, calibração, tratamento e usando as agulhas sobre as células estão completamente descritos. A força de regimes tipos de células usadas anteriormente e diferente para que estas técnicas foram aplicadas demonstrar a flexibilidade da metodologia e são dados como exemplos para futuras investigações 4-6. As vantagens técnicas são as "visualização" contínua das forças produzidas pelas manipulações ea capacidade de intervir diretamente em uma variedade de eventos celulares. Estes incluem a estimulação direta e regulação do crescimento axonal e retração 7, assim como desapego e medições mecânicas em qualquer tipo de células cultivadas 8.

Protocol

1. Fazer agulhas de vidro. Um extrator de micro-agulha ajustável é usado para fabricar agulhas com ponta cônica de cerca de 4 mm de comprimento e que estão fechados vigas sólidas. Em oposição a uma ponta longo e flexível, esta curta 4 mm de comprimento limites vibrações da ponta da agulha durante as experiências. Na região proximal da fibra de 4 mm, a agulha se reduz rapidamente a partir do diâmetro do tubo de vidro de 15 mm em 1 mm, enquanto que o distal mais de 1 mm da fibra é de 2,5 m de di…

Discussion

Técnicas para aplicar e medir forças celulares têm uma longa história 9. Nosso método foi originalmente motivado pelo trabalho de Dennis Bray, que usou agulhas de vidro semelhante ao nosso para "rebocar" os neurônios em uma taxa constante através de um dispositivo motorizado hidráulico 10. Existem muitos meios alternativos de aplicação de forças para as células que incluem: motores de passo 11, 12 esferas magnéticas, vigas microfabricated 13 e fluxos de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos as importantes contribuições do Dr. Robert E. Buxbaum no desenvolvimento desta metodologia.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
R-6 cap. Tube   Drummond Scientific Co., Broomall, PA, USA 9-000-3111 R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8″
BB-CH puller   Mecanex S.A., Geneva, Switzerland BB-CH puller Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000
0.001″ Chromel wire   Omega Engineering, Stamford, CT, USA SPCH-001-50 unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega
0.003″ Constatan wire   Omega Engineering, Stamford, CT, USA SPCI-003-50 unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool
fine forceps   Fine Science Tools, USA 91150-20 Dumont Inox #5
universal microscope boom stand   Nikon 76135 or 90430 most brands or types of boom stand will work for this use
mechanical micromanipulator   Narishige M-152 three-axis direct-drive coarse micromanipulator
hydraulic micromanipulator   Narishige MO-203 now available as MMO-203, three movable axis type
needle holder   Leica Microsystems 11520145 set of 3
single instrument holder   Leica Microsystems 11520142  
double instrument holder   Leica Microsystems 11520143  
mechanical micromanipulator   Leica Microsystems 39430001 post mount,1 prob holder, RH Model 430001
joystick mech. micromanipulator   Leica Microsystems 11520137  
Leica DM IRB   Leica Microsystems   inverted microscope
Vibraplane isolation table   Kinetic System, Boston, MA, USA 1200 series ours is model 1201-02-12
Ringcubator   self manufactured see reference 19   reference 19, requires updated controller listed below
programable temperature controller   Instrumart.com Fuji Electric PXR3 replaces the retired PXV3 temperature controller
Nikon Diaphot TMD   Nikon Instruments, Inc.   inverted microscope, circa 1980
Nikon SMZ-10 binocular dissecting   Nikon Instruments, Inc.   other dissecting microscopes will work

References

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Cite This Article
Lamoureux, P., Heidemann, S., Miller, K. E. Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development. J. Vis. Exp. (50), e2509, doi:10.3791/2509 (2011).

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