Summary

La manipulación mecánica de las neuronas para controlar el desarrollo axonal

Published: April 10, 2011
doi:

Summary

Mediciones y la aplicación directa de las fuerzas sobre las neuronas en el rango de Microdyne 2000-1000 se logran con alta precisión utilizando agujas de vidrio calibrado. Esta metodología se puede utilizar para controlar y medir varios aspectos del desarrollo axonal, incluyendo la iniciación axonal, la tensión axonal, la velocidad de elongación axonal, y vectores de fuerza.

Abstract

Manipulación de células y la extensión de los axones neuronales se puede lograr con vidrio calibrado micro fibras capaces de medir y la aplicación de fuerzas en el rango de 1,2 10-1000 μdyne. Las medidas de fuerza se obtienen mediante la observación de la Hookean flexión de las agujas de cristal, que son calibrados por un método directo y empírico 3. Necesidades de equipo y procedimientos para la fabricación, la calibración, el tratamiento y el uso de las agujas de las células se describen con detalle. La fuerza de los regímenes anteriores, los diferentes tipos de células a las que estas técnicas se han aplicado pruebas de la flexibilidad de la metodología y se dan como ejemplos para la investigación futura 4.6. Las ventajas técnicas son las continuas 'visualización' de las fuerzas producidas por la manipulación y la capacidad de intervenir directamente en una variedad de procesos celulares. Estos incluyen la estimulación directa y regulación del crecimiento axonal y la retracción del 7, así como el desprendimiento y mediciones mecánicas en cualquier tipo de cultivo celular 8.

Protocol

1. Que las agujas de cristal. Un ajuste de micro-aguja extractor se utiliza para la fabricación de agujas con punta cónica de 4 mm de longitud y que se cierran las vigas sólidas. A diferencia de una punta larga y flexible, este corto 4 mm de largo los límites de las vibraciones de la punta de la aguja durante los experimentos. En la región proximal de la fibra de 4 mm, la aguja se estrecha rápidamente a partir del diámetro del tubo de vidrio a 15 micras dentro de 1 mm, mientras que la más distal de …

Discussion

Técnicas a aplicar y medir fuerzas celulares tienen una larga historia 9. Nuestro método fue motivada inicialmente por el trabajo de Dennis Bray, que utiliza agujas de vidrio similar a la nuestra a 'remolque' las neuronas a un ritmo constante, utilizando un dispositivo motorizado hidráulico 10. Hay muchos medios alternativos de la aplicación de fuerzas a las células que son: motores paso a paso 11, 12 bolas magnéticas, rayos microfabricated 13 y los flujos de flu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos las importantes contribuciones del Dr. Robert E. Buxbaum en el desarrollo de esta metodología.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
R-6 cap. Tube   Drummond Scientific Co., Broomall, PA, USA 9-000-3111 R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8″
BB-CH puller   Mecanex S.A., Geneva, Switzerland BB-CH puller Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000
0.001″ Chromel wire   Omega Engineering, Stamford, CT, USA SPCH-001-50 unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega
0.003″ Constatan wire   Omega Engineering, Stamford, CT, USA SPCI-003-50 unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool
fine forceps   Fine Science Tools, USA 91150-20 Dumont Inox #5
universal microscope boom stand   Nikon 76135 or 90430 most brands or types of boom stand will work for this use
mechanical micromanipulator   Narishige M-152 three-axis direct-drive coarse micromanipulator
hydraulic micromanipulator   Narishige MO-203 now available as MMO-203, three movable axis type
needle holder   Leica Microsystems 11520145 set of 3
single instrument holder   Leica Microsystems 11520142  
double instrument holder   Leica Microsystems 11520143  
mechanical micromanipulator   Leica Microsystems 39430001 post mount,1 prob holder, RH Model 430001
joystick mech. micromanipulator   Leica Microsystems 11520137  
Leica DM IRB   Leica Microsystems   inverted microscope
Vibraplane isolation table   Kinetic System, Boston, MA, USA 1200 series ours is model 1201-02-12
Ringcubator   self manufactured see reference 19   reference 19, requires updated controller listed below
programable temperature controller   Instrumart.com Fuji Electric PXR3 replaces the retired PXV3 temperature controller
Nikon Diaphot TMD   Nikon Instruments, Inc.   inverted microscope, circa 1980
Nikon SMZ-10 binocular dissecting   Nikon Instruments, Inc.   other dissecting microscopes will work

References

  1. Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
  2. Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).
  3. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Haynes, L. W. . The Neuron in Tissue Culture. , 105-119 (1999).
  4. Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. Rac is required for growth cone function but not neurite assembly. J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).
  5. Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).
  6. Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
  7. Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
  8. Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts. J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).
  9. Yoneda, M. Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1. Journal of Experimental Biology. 37, (1960).
  10. Bray, D. Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture. Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).
  11. Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
  12. Fass, J. N., Odde, D. J. Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads. Biophys J. 85, 623-636 (2003).
  13. Yang, S., Saif, M. T. A. Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response. Exp Mech. 49, 135-151 (2009).
  14. Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites. Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).
  15. Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Direct evidence that growth cones pull. Nature. 340, 159-162 (1989).
  16. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Growth cone behavior and production of traction force. J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).
  17. O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
  18. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
  19. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope. Biotechniques. 35, 708-708 (2003).

Play Video

Cite This Article
Lamoureux, P., Heidemann, S., Miller, K. E. Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development. J. Vis. Exp. (50), e2509, doi:10.3791/2509 (2011).

View Video