Summary

Mekanisk Manipulation av nervceller till Control axonal utveckling

Published: April 10, 2011
doi:

Summary

Ansökan och direkta mätningar av krafter på nervceller i 2-1000 microdyne utbud uppnås med hög precision med kalibrerad glas nålar. Denna metod kan användas för att kontrollera och mäta flera aspekter av axonal utveckling, inklusive axonal initiering, axonal spänning, hastighet axonal töjning, och vektorer kraft.

Abstract

Cell manipulationer och utbyggnad av neuronala axoner kan uppnås med kalibrerad glas mikro-fibrer som kan mäta och tillämpa krafter i 1-10 μdyne intervallet 1,2. Force mätningarna erhålls genom observation av Hookean böjning av glas nålar, som är kalibrerade av ett direkt och empirisk metod 3. Utrustning krav och förfaranden för att tillverka, kalibrering, behandla och använda nålar på celler är helt beskrivs. Kraften regimer som tidigare användes och olika celltyper som dessa tekniker har tillämpats demonstrera flexibiliteten i metodik och ges som exempel för framtida utredning 4-6. De tekniska fördelarna är den kontinuerliga "visualisering" av de krafter som produceras av manipulationer och möjlighet att direkt ingripa i en mängd av cellulära händelser. Dessa inkluderar direkt stimulering och reglering av axonal tillväxt och retraktion 7, samt avskildhet och mekaniska mätningar på alla typer av odlade celler 8.

Protocol

1. Göra glas nålar. En justerbar micro-nål avdragare används för att tillverka nålar med ett avsmalnande spets ca 4 mm i längd och som är stängda fasta balkar. I motsats till en lång, böjlig spets, begränsar denna korta 4 mm längd vibrationer nålspetsen under experiment. Vid proximala region 4 mm fiber, vaxljus nålen snabbt från diameter glasrör till 15 ìm inom 1 mm, medan den distala-högst 1 mm av fiber är 2,5 mikrometer i diameter. Vi använder R-6 glas kapillärrör, OD 0,9 mm, ID 0,6…

Discussion

Tekniker för att tillämpa och mäta cellulära krafter har en lång historia 9. Vår metod var ursprungligen motiverades av arbete Dennis Bray, som använde glas nålar liknar vår att "bogsera" nervceller med en konstant hastighet med hjälp av en motordriven hydraulisk enhet 10. Det finns många alternativa sätt att tillämpa krafter till celler som inkluderar: stegmotorer 11, magnetiska kulor 12, mikrofabricerade balkar 13 och flöden vätska 14…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi erkänner tacksamt de viktiga bidrag av Dr Robert E. Buxbaum i utvecklingen av denna metod.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
R-6 cap. Tube   Drummond Scientific Co., Broomall, PA, USA 9-000-3111 R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8″
BB-CH puller   Mecanex S.A., Geneva, Switzerland BB-CH puller Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000
0.001″ Chromel wire   Omega Engineering, Stamford, CT, USA SPCH-001-50 unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega
0.003″ Constatan wire   Omega Engineering, Stamford, CT, USA SPCI-003-50 unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool
fine forceps   Fine Science Tools, USA 91150-20 Dumont Inox #5
universal microscope boom stand   Nikon 76135 or 90430 most brands or types of boom stand will work for this use
mechanical micromanipulator   Narishige M-152 three-axis direct-drive coarse micromanipulator
hydraulic micromanipulator   Narishige MO-203 now available as MMO-203, three movable axis type
needle holder   Leica Microsystems 11520145 set of 3
single instrument holder   Leica Microsystems 11520142  
double instrument holder   Leica Microsystems 11520143  
mechanical micromanipulator   Leica Microsystems 39430001 post mount,1 prob holder, RH Model 430001
joystick mech. micromanipulator   Leica Microsystems 11520137  
Leica DM IRB   Leica Microsystems   inverted microscope
Vibraplane isolation table   Kinetic System, Boston, MA, USA 1200 series ours is model 1201-02-12
Ringcubator   self manufactured see reference 19   reference 19, requires updated controller listed below
programable temperature controller   Instrumart.com Fuji Electric PXR3 replaces the retired PXV3 temperature controller
Nikon Diaphot TMD   Nikon Instruments, Inc.   inverted microscope, circa 1980
Nikon SMZ-10 binocular dissecting   Nikon Instruments, Inc.   other dissecting microscopes will work

References

  1. Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
  2. Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).
  3. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Haynes, L. W. . The Neuron in Tissue Culture. , 105-119 (1999).
  4. Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. Rac is required for growth cone function but not neurite assembly. J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).
  5. Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).
  6. Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
  7. Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
  8. Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts. J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).
  9. Yoneda, M. Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1. Journal of Experimental Biology. 37, (1960).
  10. Bray, D. Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture. Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).
  11. Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
  12. Fass, J. N., Odde, D. J. Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads. Biophys J. 85, 623-636 (2003).
  13. Yang, S., Saif, M. T. A. Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response. Exp Mech. 49, 135-151 (2009).
  14. Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites. Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).
  15. Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Direct evidence that growth cones pull. Nature. 340, 159-162 (1989).
  16. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Growth cone behavior and production of traction force. J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).
  17. O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
  18. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
  19. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope. Biotechniques. 35, 708-708 (2003).

Play Video

Cite This Article
Lamoureux, P., Heidemann, S., Miller, K. E. Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development. J. Vis. Exp. (50), e2509, doi:10.3791/2509 (2011).

View Video