Summary
कैल्शियम तंत्रिका तंत्र में एक सर्वव्यापी दूत, synaptic शक्ति में neurotransmitter रिहाई और परिवर्तन को ट्रिगर करने के लिए आवश्यक है. यहाँ हम ड्रोसोफिला तंत्रिका टर्मिनलों में + संकेतक 2 Ca लोड करने के लिए एक तकनीक का प्रदर्शन . हम भी आवश्यक तंत्र के निर्माण का प्रदर्शन और है तकनीक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण बिंदुओं पर जोर.
Abstract
कैल्शियम तंत्रिका तंत्र में कई भूमिका निभाता है लेकिन कोई भी neurotransmitter रिहाई के लिए ट्रिगर के रूप में की तुलना में अधिक प्रभावशाली है, और कोई भी synaptic plasticity है कि सीखने और स्मृति का समर्थन करता है के लिए आवश्यक दूत के रूप में की तुलना में अधिक गहरा है. आगे Ca 2 के आणविक आधार स्पष्ट + निर्भर synaptic तंत्र, एक मॉडल प्रणाली की आवश्यकता है कि दोनों आनुवंशिक निंदनीय और physiologically से सुलभ है. ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर इस तरह के एक मॉडल उपलब्ध कराता है. इस प्रणाली में, अनुवांशिक इनकोडिंग फ्लोरोसेंट संकेतक तंत्रिका टर्मिनलों में Ca 2 + परिवर्तन का पता लगाने के लिए उपलब्ध हैं. हालांकि, इन संकेतकों 2 Ca के लिए संवेदनशीलता सीमित है + और अक्सर एक गैर रेखीय प्रतिक्रिया दिखा. सिंथेटिक फ्लोरोसेंट संकेतक बेहतर तेजी Ca 2 + तंत्रिका गतिविधि के साथ जुड़े परिवर्तन को मापने के लिए उपयुक्त हैं. यहाँ हम ड्रोसोफिला लार्वा में रहते तंत्रिका टर्मिनलों में dextran संयुग्मित सिंथेटिक Ca 2 + संकेतक लोड करने के लिए एक तकनीक का प्रदर्शन . सबसे पृथक नसों के साथ स्थैतिक बिजली निर्वहन कैसे से बचने के लिए, विस्तारित लोड हो रहा है अवधि के दौरान की तैयारी के स्वास्थ्य को बनाए रखने के जैसे है तकनीक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है, प्रोटोकॉल के उन पहलुओं पर विशेष जोर रखा है, और 2 Ca द्वारा प्रदान अक्षतंतु अस्तित्व को सुनिश्चित करने + कटे अक्षतंतु अंत की सील को बढ़ावा देने के लिए. निम्न आत्मीयता dextran संयुग्मित Ca 2 + fluo-4 और rhod जैसे संकेतक, उपलब्ध है जो एक उच्च संकेत से शोर अनुपात दिखाने जबकि न्यूनतम + गतिशीलता presynaptic 2 Ca में खलल न डालें . Dextran - संयुग्मन को रोकने Ca 2 + संकेतक mitochondria जैसे organelles में तनहा जा रहा में मदद करता है. लोड हो रहा तकनीक लार्वा भ्रूण, और वयस्कों के लिए समान रूप से लागू किया जा सकता है.
Protocol
- चुनें एक स्वच्छ विच्छेदन पकवान है कि किसी fixatives को उजागर नहीं किया गया.
- एक भटक 3 श्नाइडर ड्रोसोफिला मध्यम 2 Ca युक्त में तीसरी instar ड्रोसोफिला लार्वा काटना + और एल glutamine, (किसी भी नसों या क्षति मांसपेशी फाइबर नग 7, 6, 13 या 12 में कटौती नहीं है).
- (आंतरिक व्यास) एक 12 माइक्रोन टिप के साथ एक गिलास भरने के विंदुक का चयन करें.
- (विंदुक के लिए नकारात्मक दबाव लागू) एक सिरिंज और टयूबिंग का उपयोग सुनिश्चित करें कि विंदुक टिप बाधित नहीं है.
- ठीक एक प्लास्टिक भरने फिलामेंट कि नीचे डाला जा सकता है गिलास पिपेट की लंबाई का चयन करें.
- प्लास्टिक फिलामेंट में + सूचक ~ 5 मिमी dextran संयुग्मित Ca 2 के 1 सेमी ड्रा.
- सभी खंड नसों कट.
- समर्थन विंदुक कि विंदुक टिप dissected लार्वा के उदर midline दृष्टिकोण करने की अनुमति देगा एक रैंप पर.
- No.4 खंड के लिए एक तंत्रिका के अंत में कटौती ड्रा, तंत्रिका बन्द रखो बिना विंदुक के अंत (Schneider मध्यम की एक छोटी राशि शामिल हैं) में.
- टयूबिंग निकालें और विंदुक में प्लास्टिक फिलामेंट सम्मिलित फिलामेंट के अंत तक तंत्रिका की कटौती के अंत में 50 microns के भीतर है (तंत्रिका छू से बचने के लिए).
- निकालें पर्याप्त 2 Ca + के बारे में 33% (अंतिम एकाग्रता <2mm होना चाहिए) द्वारा श्नाइडर माध्यम की मात्रा में वृद्धि समाप्त तंत्रिका पर सूचक . महत्वपूर्ण - यह तंत्रिका काटने के 5 मिनट के भीतर पूरा किया जाना चाहिए है.
- कमरे के तापमान पर अंधेरे में तैयार रखें जबकि तंत्रिका भार.
- 40 मिनट के बाद 2 + सूचक Ca फिलामेंट का उपयोग निकालें .
- जगह में पिपेट छोड़ दो और यह पूरी तरह से ताजा है Schneider मध्यम के साथ भरने के रूप में इस तंत्रिका उत्तेजक दालों लागू किया जाएगा.
- 2 Ca + सूचक तंत्रिका में कम से कम 60 मिनट के लिए संतुलित करने की अनुमति दें, लेकिन चार घंटे से अधिक नहीं, 2 + इमेजिंग Ca आरंभ करने से पहले.
- ताजा है Schneider मध्यम हर 30 मिनट, जबकि यह equilibrating है के साथ तैयार कुल्ला.
- इमेजिंग 20 मिनट पहले No.6 समाधान Hemolymph की तरह (, Macleod एट अल 2002, 2003 HL6) के साथ Schneider मध्यम जगह.
- एल glutamic एसिड या ग्लूटामेट 7mm पर HL6 समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है के लिए postsynaptic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स असंवेदनशील तंत्रिका पैदा मांसपेशी संकुचन को रोकने के (Macleod एट अल 2004;. Reiff एट अल 2002, 2005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | must contain L-glutamine and calcium |
| L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | G1626 |
References
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
- Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
