이 프로토콜은 형광 이미징에 의해 mitochondrial 칼슘 fluxes의 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 이 메서드는 선택 mitochondria로 표현 circularly permutated YFP 기반 듀얼 여기 ratiometric 칼슘 센서 (ratiometric pericam – MT)을 활용합니다.
다양한 자극에 대한 응답으로 세포 내 칼슘 농도의 동적 변화는 확산, 분화 및 apoptosis 한 많은 세포 과정을 조절. mitochondria에서 apoptosis, 칼슘 축적하는 동안 프로 apoptotic 요소의 릴리스는 cytosol이에 mitochondria에서 추진하고 있습니다. 직접 apoptosis 동안 현장에서 살아있는 세포에서 mitochondrial 칼슘을 측정하기 위해 관심을 따라서이다. 듀얼 여기 ratiometric 및 비 ratiometric 합성 칼슘 지표 염료와 함께 로드된 세포의 고해상도 형광 이미징은 세포내 칼슘 신호의 다양한 측면을 연구하기위한 신뢰성과 다양한 도구로 입증되었습니다. 이러한 기술을 사용 cytosolic 칼슘 fluxes을 측정하는 것은 비교적 간단합니다. 그러나,로드 '- 2 및로드'- FF로 합성 칼슘 지표를 사용하여 손상 세포 intramitochondrial 칼슘 수준을 측정하는 것은 더욱 어려운 것입니다. mitochondria를 타겟으로 합성 지표 mitochondrial 칼슘 반복 증가에 대한 답변을 무딘하고, mitochondrial 형태학에게 3 중단합니다. 또한, 합성 지표는 장기적인 실험들이 적합하게 몇 시간 동안 mitochondria 밖으로 누설하는 경향이있다. 따라서, mitochondria를 타겟으로하는 녹색 형광 단백질 (GFP) 4 aequorin 5를 기반으로 유전자 인코딩 칼슘 지표는 크게 mitochondrial 칼슘 역학의 측정을 촉진합니다. 여기, 우리는 다른 자극에 대한 응답으로 mitochondrial 칼슘 fluxes의 실시간 측정을위한 간단한 방법을 설명합니다. 방법을 선택 mitochondria을 타겟으로하는 'ratiometric – pericam'의 형광 현미경을 기반으로합니다. Ratiometric pericam는 circularly permuted 노란색 형광 단백질과 calmodulin 4 핵융합 기반으로 칼슘 표시기입니다. 방출 스펙트럼, 봉우리 주변에 515 nm의은 변함이 동안 ratiometric pericam에 칼슘의 바인딩은 415 nm의에 494 nm의 여기로부터 피크의 변화가 발생합니다. Ratiometric pericam는 ~ 1.7 μm의 4 체외에서 상수를 분리하여 하나의 칼슘 이온을 바인딩합니다. ratiometric pericam 이러한 특성 mitochondrial 칼슘 농도에 신속하고 장기적인 변화의 부량을 허용합니다. 또한, 우리는 일반적으로 사용 가능한 필터 세트와 표준 넓은 분야 칼슘 이미징 현미경이 방법의 적응을 설명합니다. 별개의 두 agonists, purinergic 작용제 ATP와 apoptosis – 유도하는 약물 staurosporine을 사용하여, 우리는이 방법은 시간이 초 시간적 해상도 mitochondrial 칼슘 농도의 변화를 모니터링에 적합한 것을 보여줍니다. 또한, 우리는 ratiometric pericam 또한 apoptosis 동안 mitochondrial 분열 / 조각을 측정하는 데 유용 것을 보여줍니다. 따라서 ratiometric pericam은 특히 apoptosis 동안 mitochondrial 칼슘 역학의 지속적인 장기 측정에 가장 적합합니다.
여기 mitochondrial 타겟 ratiometric pericam를 사용하여 mitochondrial 칼슘을 측정하는 매우 간단한 방법을 제시한다. 것처럼 쉽게 허용 신호 대 잡음 비율과 헬라 세포에서 개별 mitochondria를 볼 수 있습니다 없음 deconvolution 표준 위드 광학을 사용하여 그림 1A에 표시됩니다. 공촛점 현미경 또는 기타 전문 장비에 대한 필요성을 obviating 때 자기편 헬라 세포는 문화에 대부분의 세포처럼 크게 버리고 있기 때문입니다. 우리는 폴리 – 리신 코팅 coverslips 8 준수 Jurkat 세포에서 유사한 결과를 발견했다. 염료를 사용하는 방법을 대조적으로, 그것은 비 invasively 같은 ratiometric pericam (그림 1E)로 인코딩된 유전자 칼슘 표시기를 사용하여 시간 mitochondrial 칼슘 수준을 모니터링하는 것도 가능합니다. 세포 죽음 동안 mitochondrial 칼슘을 분석 때 특히 중요합니다. 또한, 그것은 apoptotic 과정에서 분열 / mitochondria의 조각을 시각화하는 것도 가능합니다. 와 같은 인물 1D와 E에 나타난 staurosporine 치료는 20 분 mitochondria있는 봉우리를 선택 subpopulations에서 칼슘 느린 증가됩니다. 칼슘 수준은 다시 이시간 치료 후 다시 올라가기 전에 mitochondrial 조각과 함께 수반하는 내려가. 이것은 Fura – 2 9를 사용하여 측정 staurosporine 처리에 의해 유도된 cytosolic 칼슘 느린 파도와 일치합니다. 따라서, 중요한 운동 정보가있는 정적 측정을 고용하는 방법으로 가능하지 않다 얻을 수 있습니다. 우리가 비율과 그림 1에없는 칼슘 농도를 제시했지만, 그것은 절대 칼슘 레벨 4, 10를 계산하기 위해 현장에서 센서를 보정하는 것이 가능합니다. 고려해야 할 한 가지 중요한 주의해야 할 점은 ratiometric pericam는 산도 4, 10 민감한 때문입니다. 모두 cytosolic 및 mitochondrial 산도 수준은 apoptosis 11 동안 극적으로 변화 수 있듯이, 이것은 중요한 고려 사항이다. 절연 mitochondria 표현 pericam에서 산도의 적정가 입증되는 증가 [H +] 증가 410 nm의에서 여기, 동시에 mitochondrial 칼슘을 모두 측정하는 악용되어 속성에 의해 자극 방출에 약간의 영향으로 495 nm의에서 흥분 pericam의 방출 및 산도 12. 따라서, 선택 410 나노미터 여기와 방출을 모니터링하는 것은 산도에 대한 감소 우려와 비 ratiometrically 모니터 mitochondrial 칼슘하기위한 수단을 제공합니다. 마지막으로, 여기에 제시된 프로토콜은 따라서 대부분의 실험실로이 기술을 이용할 수 있도록, 광범위하게 사용 가능한 필터와 표준 epifluorescent 현미경에 액세스할 수 있어야합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 ratiometric – pericam – MT 표현 구조와 함께 우리를 제공 아츠시 미야 와키 감사하고 싶습니다. 이 작품은 국립 보건원 (DB)에서 부여 GM081685에 의해 지원되었다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. | |
Imaging Software | Molecular Devices, Inc | Metafluor | ||
Attofluor cell chamber | Invitrogen Corporation | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen Corporation | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies | |
MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen Corporation | M7512 |