Ce protocole décrit une méthode pour mesurer en temps réel des flux de calcium mitochondrial par imagerie de fluorescence. La méthode tire parti d'une circulaire permuté YFP à base de capteurs de calcium à double excitation ratiométrique (ratiométrique pericam-mt) sélectivement exprimé dans les mitochondries.
Changements dynamiques de la concentration de calcium intracellulaire en réponse à divers stimuli régule de nombreux processus cellulaires comme la prolifération, la différenciation et l'apoptose 1. Pendant l'accumulation de calcium apoptose, dans les mitochondries favorise la libération de facteurs pro-apoptotiques de la mitochondrie dans le cytosol 2. Il est donc intéressant de mesurer directement le calcium mitochondrial dans les cellules vivantes in situ lors de l'apoptose. Imagerie à haute résolution fluorescent de cellules chargées avec double excitation ratiométrique et non-ratiométrique colorants synthétiques indicateur de calcium a été prouvé être un outil fiable et polyvalent pour étudier divers aspects de la signalisation du calcium intracellulaire. Mesurer les flux de calcium cytosolique utilisant ces techniques est relativement simple. Toutefois, la mesure des niveaux de calcium dans les cellules intactes intramitochondriales en utilisant des indicateurs tels que le calcium synthétique Rhod-2 et Rhod-FF est plus difficile. Des indicateurs synthétiques destinés aux mitochondries ont émoussé les réponses aux augmentations répétitives en calcium mitochondrial, et perturber la morphologie mitochondriale 3. En outre, les indicateurs synthétiques ont tendance à s'échapper des mitochondries pendant plusieurs heures ce qui les rend impropres à long terme des expériences. Ainsi, les indicateurs de calcium codées génétiquement basé sur la protéine fluorescente verte (GFP) 4 ou 5 aequorine ciblée vers les mitochondries ont grandement facilité la mesure de la dynamique du calcium mitochondrial. Ici, nous décrivons une méthode simple pour mesurer en temps réel des flux de calcium mitochondrial en réponse à différents stimuli. La méthode est basée sur la microscopie par fluorescence de «ratiométrique-pericam 'qui est sélectivement ciblé à la mitochondrie. Ratiométrique pericam est un indicateur de calcium repose sur une fusion de circulairement permuté protéine fluorescente jaune et calmoduline 4. Liaison du calcium à pericam ratiométrique provoque un décalage de son pic d'excitation de 415 nm à 494 nm, tandis que le spectre d'émission, qui culmine autour de 515 nm, reste inchangé. Ratiométrique pericam lie un ion calcium unique avec une constante de dissociation in vitro de ~ 1,7 uM 4. Ces propriétés permettent d'pericam ratiométrique la quantification des changements rapides et à long terme de la concentration de calcium mitochondrial. Par ailleurs, nous décrivons l'adaptation de cette méthodologie à un niveau large champ de microscope d'imagerie calcique avec des jeux de filtres couramment disponibles. L'utilisation de deux agonistes distincts, l'agoniste purinergiques ATP et la drogue staurosporine inducteur d'apoptose, nous démontrons que cette méthode est appropriée pour la surveillance des changements dans la concentration de calcium mitochondrial avec une résolution temporelle de secondes à plusieurs heures. Par ailleurs, nous montrent aussi que pericam ratiométrique est également utile pour mesurer la fission mitochondriale / fragmentation lors de l'apoptose. Ainsi, pericam ratiométrique est particulièrement bien adapté pour continu à long terme de mesure de la dynamique mitochondriale de calcium pendant l'apoptose.
Nous présentons ici une méthode très simple pour mesurer le calcium mitochondrial mitochondrial aide ciblée pericam ratiométrique. Comme le montre la figure 1A, en utilisant la norme optiques grand champ sans déconvolution, il est possible de visualiser facilement des mitochondries dans les cellules HeLa individuels avec acceptables signal-bruit. C'est parce que les cellules HeLa, comme la plupart des cellules en culture, s'aplatissent de façon significative lorsque adhérente évitant la nécessité pour la microscopie confocale ou d'autres équipements spécialisés. Nous avons trouvé des résultats similaires dans les cellules Jurkat respectées poly-lysine lamelles revêtement 8. Contrairement aux méthodes d'utilisation de colorants, il est également possible de façon non invasive de surveiller les niveaux de calcium mitochondrial pendant des heures en utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés tels que ratiométrique pericam (figure 1E). Ceci est particulièrement important lors de l'analyse du calcium mitochondrial lors de la mort cellulaire. Par ailleurs, il est également possible de visualiser la fission / fragmentation des mitochondries au cours du processus apoptotique. Comme indiqué dans les figures 1D et E, le traitement des causes staurosporine une lente augmentation de calcium dans les sous-populations de sélectionner des mitochondries qui culmine à 20 minutes. Les taux de calcium redescendre concomitante avec la fragmentation mitochondriale avant de monter à nouveau deux heures après le traitement. Ceci est cohérent avec les ondes lentes en calcium cytosolique induite par le traitement staurosporine mesurée en utilisant Fura-2 9. Ainsi, d'importantes informations cinétiques peuvent être obtenus qui n'est pas possible avec les méthodes employant des mesures statiques. Bien que nous ayons présenté les rapports et les concentrations de calcium n'est pas dans la figure 1, il est possible d'étalonner le capteur in situ afin de calculer les niveaux de calcium absolue 4, 10. Une mise en garde importante à considérer est que pericam ratiométrique est sensible au pH 4, 10. Comme les deux niveaux de pH cytosolique et mitochondrial peut changer de façon spectaculaire lors de l'apoptose 11, c'est une considération importante. Le titrage de pH dans des régions isolées pericam exprimer mitochondries montrent que l'augmentation de [H +] d'émission des augmentations de pericam lorsqu'il est excité à 495 nm, avec peu d'effet sur l'émission stimulée par excitation à 410 nm, une propriété qui a été exploitée pour mesurer simultanément le calcium mitochondrial et pH 12. Ainsi, de façon sélective le contrôle des émissions à 410 nm d'excitation fournit un moyen de surveiller le calcium non ratiometrically mitochondriale avec inquiétude réduite pour le pH. Enfin, le protocole présenté ici ne requiert que l'accès à un microscope standard avec des filtres à épifluorescence largement disponibles, ce qui rend cette technique accessible à la plupart des laboratoires.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Atsushi Miyawaki de nous avoir fourni la construction d'expression ratiométrique-pericam-mt. Ce travail a été soutenu par des subventions GM081685 des National Institutes of Health (DB).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. | |
Imaging Software | Molecular Devices, Inc | Metafluor | ||
Attofluor cell chamber | Invitrogen Corporation | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen Corporation | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies | |
MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen Corporation | M7512 |