Summary
इस प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा वास्तविक समय mitochondrial कैल्शियम अपशिष्टों की माप के लिए एक विधि का वर्णन करता है. विधि एक circularly permutated YFP आधारित दोहरे उत्तेजना ratiometric कैल्शियम (ratiometric pericam - लाख टन) सेंसर चुनिंदा mitochondria में व्यक्त का लाभ लेता है.
Protocol
1. Pericam लाख टन अभिकर्मक और सेल तैयार.
- प्लेट HELA कोशिकाओं बाँझ गिलास एक मानक संस्कृति 6 अच्छी तरह से थाली में रखा coverslips पर अभिकर्मक पहले रात.
- डीएनए Lipofectamine / 2000 परिसरों की तैयारी के रूप में निर्माता (Invitrogen) द्वारा सुझाए. हम ratiometric - pericam लाख टन अभिव्यक्ति वेक्टर के 4 μg और Lipofectamine Opti-सदस्य की 0.5 एमएल में पतला प्रत्येक के लिए अच्छी तरह 2000 के 10 μL का उपयोग करें. कोशिकाओं ~ 70% मिला हुआ अभिकर्मक पहले किया जाना चाहिए.
- प्रत्येक अच्छी तरह से एंटीबायोटिक दवाओं के बिना ही मीडिया के 1.5 एमएल HeLa संस्कृति मीडिया (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, 10% FBS, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ बदलें.
- प्रत्येक के लिए ट्रांसफ़ेक्ट अच्छी तरह से हो डीएनए / Lipofectamine परिसरों जोड़ें. 37 ओ सी, 5% सीओ 2 और 4 घंटे के लिए एक सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर में कमाल सेते साथ धीरे मिश्रण.
- एंटीबायोटिक स्वतंत्र मीडिया एंटीबायोटिक दवाओं के साथ संस्कृति और मीडिया के साथ बदलें. कोशिकाओं इमेजिंग पहले 1-2 दिनों के लिए ratiometric pericam व्यक्त करने की अनुमति दें.
2. माइक्रोस्कोप सेटअप और छवि अधिग्रहण
- 107mM NaCl, 7.2mM KCl, 1.2mm 2 MgCl, 1mm CaCl 2, 11.5mm ग्लूकोज, 0.1% गोजातीय सीरम albumin, और 20mm 7.2 HEPES: इमेजिंग समाधान के साथ एक उपयुक्त इमेजिंग कक्ष में HELA कोशिकाओं के साथ एक coverslip रखें . हमारी प्रयोगशाला Invitrogen से Attofluor सेल कक्ष का उपयोग करता है. एक औंधा माइक्रोस्कोप चरण में इमेजिंग कक्ष माउंट.
- एक या एक से अधिक ratiometric pericam का उपयोग कर एक 40x (या अधिक) तेल विसर्जन उद्देश्य व्यक्त कोशिकाओं से युक्त हित के एक क्षेत्र का पता लगाएं. हमने पाया है कि ratiometric pericam कम 380 एनएम photobleaching प्रतिरोधी है, और इस तरह हम इस तरंग दैर्ध्य का उपयोग करने के लिए उपयुक्त की कोशिकाओं की पहचान है. चित्र 1 में अधिग्रहीत छवियों के लिए, एक 1.3 संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक Nikon Superfluor 40x उद्देश्य में इस्तेमाल किया गया था. उच्च बढ़ाई उद्देश्यों को भी उपयुक्त हो (60 100x). उत्तेजना प्रयुक्त फ़िल्टर Chroma प्रौद्योगिकी फिल्टर D380/30x थे (380 + / - 30 एनएम) और D495/10 (495 + / - 5 एनएम), beamsplitter 505DCXR (505nm longpass) था, और उत्सर्जन फिल्टर HQ535/50m (535 + / था - 25nm).
हमारी चित्रा 1 में छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल सूक्ष्मदर्शी एक Nikon TE2000 उल्टे एक नट वैज्ञानिक Coolsnap मुख्यालय ठंडा सीसीडी कैमरा, Ludl MAC6000 तेजी से फिल्टर पहिया और परिवर्तक, और एक MetaFluor डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के होते हैं. इस प्रोटोकॉल उपयुक्त फिल्टर और ratiometric छवियों पर कब्जा करने और प्रसंस्करण के लिए सक्षम सॉफ्टवेयर के साथ किसी भी मानक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. - दोहरी 495 और 380 एनएम फिल्टर का उपयोग उत्तेजना के लिए सॉफ्टवेयर स्थापित. Ratiometric pericam के लिए बाध्य कैल्शियम 495 एनएम पर absorbance बढ़ जाती है, इस प्रकार अनुपात स्थापित किया जाना चाहिए 495 nm/380 एनएम हो.
Ratiometric pericam एक कैल्शियम 415 एनएम 4 पर मुक्त उत्तेजना शिखर है. इस प्रोटोकॉल में हम सुझाव है कि एक 380 एनएम फिल्टर का उपयोग केवल क्योंकि यह सबसे कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगशालाओं में सर्वव्यापी है. यदि एक 410 एनएम फिल्टर उपलब्ध है, यह 380 एनएम फिल्टर करने के लिए बेहतर है. - क्रमिक रूप से वैकल्पिक रूप से 495 और 380 एनएम पर रोमांचक छवियों मोल. Agonist एक छिड़काव तंत्र के माध्यम से आवेदन करने से पहले कम से कम 30 एस के लिए आधारभूत कैल्शियम का स्तर की छवियों का मोल. इसके अलावा समय के लिए प्रत्येक agonist मार्क. एक्स्पोज़र समय और अधिग्रहण अंतराल, जबकि अभी भी पर्याप्त लौकिक resolution.For उदाहरण अर्द्ध तेजी से कैल्शियम agonist उत्तेजना के जवाब में निगरानी गतिशीलता के लिए अनुमति photobleaching को रोकने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, छवियों आंकड़े 1B और सी. बहुत तेजी से अधिग्रहण की दर में हर दो सेकंड का अधिग्रहण किया गया भी संभव है 6. Staurosporine प्रशासन के बाद लंबे समय तक इमेजिंग अधिग्रहण के बीच एक लंबे अंतराल (30) (1 डी और ई आंकड़े) के साथ प्राप्त किया गया था.
3. इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण
- एक बार प्रयोग पूरा हो गया है, प्राप्त छवियों ऑफ़लाइन विश्लेषण किया जा सकता है. ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) है जिसमें आप कैल्शियम के स्तर में परिवर्तन की निगरानी करना चाहते हैं परिभाषित करें. एक क्षेत्र के एक खाली क्षेत्र के भीतर चयनित पृष्ठभूमि घटाना यदि आवश्यक रॉय का उपयोग करें. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि mitochondria काफी गतिशील और गतिशील हैं, और विस्तारित अवधि के ऊपर एक एकल mitochondrion में extrapolating घटनाओं हमेशा संभव नहीं है. इस प्रकार, कुछ प्रकार की कोशिकाओं में इस organelle के उच्च गतिशीलता पर विचार आरओआई का चयन सावधानी से नजर रखी जाना चाहिए. इसके अलावा, के रूप में चित्रा 1, विभिन्न stimuli करने के लिए mitochondria प्रतिक्रिया heterogeneously में evidenced. इसलिए यह महत्वपूर्ण डेटा को ऑफ़लाइन विश्लेषण और फ्रेम आधार द्वारा एक फ्रेम पर RO1 नियुक्ति की निगरानी है. अत्यधिक गतिशील mitochondria में mitochondrial कैल्शियम को मापने का एक विस्तृत वर्णन 7 कहीं वर्णित किया गया है.
- रॉय से प्राप्त अनुपात माप Excel या इसी तरह graphingsoftware में आयात किया जा सकता है. डेटा किसी एकल कक्ष या एकल mitochondrion में mitochondrial कैल्शियम स्तर में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करने का पता लगाने के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है है, या fl औसतकई रॉय से uorescence संकेतों. हम भी इस तकनीक का इस्तेमाल किया है औसत फैस ligand 8 द्वारा प्रेरित apoptosis के दौर से गुजर लिम्फोसाइटों की आबादी में mitochondrial कैल्शियम के स्तर को मापने.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1. (ए) ratiometric - pericam - लाख टन के Subcellular स्थानीयकरण. यह पहली छवि रहते HeLa ratiometric - pericam लाख टन व्यक्त सेल से पता चलता है. दूसरी छवि mitochondrion चयनात्मक डाई MitoTracker लाल CMXRos के साथ फ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना दिखाता है. मर्ज किए गए छवि में पीले प्रतिदीप्ति ratiometric pericam - मीट्रिक टन और MitoTracker प्रतिदीप्ति सह स्थानीयकरण दर्शाता है. (बी) pseudocolor अनुपात (495:380 एनएम) mt-ratiometric 10 मिमी एटीपी के साथ इलाज pericam व्यक्त 4 HELA कोशिकाओं की छवियों की एक श्रृंखला (सी). हित के क्षेत्र (आरओआई) में mitochondrial कैल्शियम स्तर में परिवर्तन की मात्रा (बी) 10 मिमी एटीपी के साथ इलाज किया. pseudocolor अनुपात (495:380 एनएम) एक HeLa लाख टन व्यक्त सेल की छवियों की श्रृंखला (डी) में संकेत दिया ratiometric pericam 0.5 सुक्ष्ममापी staurosporine के साथ इलाज किया. व्यक्तिगत mitochondria में कैल्शियम की प्रतिक्रिया में विविधता स्पष्ट है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 60 मिनट के द्वारा mitochondria की महत्वपूर्ण विखंडन है. कुछ mitochondria कैल्शियम (सफेद तीर सिर) में oscillatory वृद्धि है, जबकि दूसरों को कैल्शियम स्तर में महत्वपूर्ण परिवर्तन (पीले तीर सिर) (ई) apoptosis के साथ अधिष्ठापन के बाद वैश्विक एक एकल HeLa सेल में mitochondrial कैल्शियम स्तर में वृद्धि की मात्रा नहीं दिखा . 0.5 सुक्ष्ममापी staurosporine.
Discussion
यहाँ हम mitochondrial - लक्षित ratiometric pericam का उपयोग कर mitochondrial कैल्शियम को मापने के लिए एक बहुत ही सरल विधि प्रस्तुत करते हैं. जैसा कि चित्र 1A में दिखाया गया है, कोई deconvolution के साथ मानक widefield प्रकाशिकी का उपयोग यह संभव है करने के लिए आसानी से HELA कोशिकाओं में स्वीकार्य संकेत से शोर अनुपात के साथ अलग - अलग mitochondria देखने. यह है क्योंकि HELA कोशिकाओं, संस्कृति में सबसे अधिक कोशिकाओं की तरह, बाहर काफी समतल जब पक्षपाती confocal माइक्रोस्कोपी या अन्य विशेष उपकरणों के लिए की जरूरत है obviating. हम Jurkat कोशिकाओं पाली lysine लेपित 8 coverslips पालन में इसी तरह के परिणाम मिल गया है. रंगों का उपयोग के तरीके के विपरीत, यह भी संभव है के लिए गैर invasively आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ratiometric pericam (चित्रा 1E) के रूप में कैल्शियम संकेतकों का उपयोग घंटे के लिए mitochondrial कैल्शियम का स्तर की निगरानी. यह खासकर तब महत्वपूर्ण है जब कोशिका मृत्यु के दौरान mitochondrial कैल्शियम का विश्लेषण. इसके अलावा, यह भी संभव है apoptotic प्रक्रिया के दौरान विखंडन / mitochondria के विखंडन कल्पना. के रूप में आंकड़े 1D और ई में दिखाया गया है, staurosporine उपचार 20 मिनट में mitochondria जो चोटियों का चयन subpopulations में कैल्शियम में धीमी वृद्धि का कारण बनता है. कैल्शियम का स्तर नीचे जाने के उपचार के बाद 2 घंटे के फिर से जाने से पहले फिर से mitochondrial विखंडन के साथ सहवर्ती. यह staurosporine मापा उपचार Fura - 9 2 उपयोग से प्रेरित साइटोसोलिक कैल्शियम में धीमी गति से लहरों के साथ संगत है . इस प्रकार, महत्वपूर्ण गतिज जानकारी प्राप्त हो सकता है जो स्थिर माप रोजगार के तरीकों के साथ संभव नहीं है सकते हैं. हालांकि हम अनुपात और चित्रा 1 में नहीं सांद्रता कैल्शियम प्रस्तुत किया है, यह संभव है कि बगल में सेंसर जांचना निरपेक्ष कैल्शियम स्तर 4, 10 की गणना . पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण चेतावनी है कि ratiometric pericam पीएच 4, 10 संवेदनशील है. के रूप में दोनों साइटोसोलिक और mitochondrial पीएच स्तर को नाटकीय रूप से 11 apoptosis दौरान बदल सकते हैं, यह एक महत्वपूर्ण विचार है. पृथक mitochondria व्यक्त pericam में पीएच के अनुमापन दिखाना है कि बढ़ती [H +] pericam के उत्सर्जन बढ़ता है जब 495 एनएम पर 410 एनएम पर उत्तेजना, जो शोषण किया गया है एक संपत्ति के लिए एक साथ दोनों mitochondrial कैल्शियम को मापने के द्वारा प्रेरित उत्सर्जन पर थोड़ा प्रभाव के साथ , उत्साहित और 12 पीएच. इस प्रकार, चुनिंदा 410 एनएम उत्तेजना के साथ उत्सर्जन निगरानी पीएच के लिए कम चिंता के साथ गैर ratiometrically मॉनिटर mitochondrial कैल्शियम के लिए एक साधन प्रदान करता है. अंत में, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल केवल व्यापक रूप से उपलब्ध फिल्टर के साथ एक मानक epifluorescent खुर्दबीन उपयोग की आवश्यकता है, इस प्रकार इस तकनीक का सबसे प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बना.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम Atsushi Miyawaki हमें अभिव्यक्ति ratiometric pericam - मीट्रिक टन के निर्माण के साथ प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (DB) से यह काम GM081685 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon Instruments | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. |
| Imaging Software | Molecular Devices | Metafluor | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 |
References
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