Detta protokoll beskriver en metod för realtids mätning av mitokondrie-kalcium flöden av fluorescerande avbildning. Metoden utnyttjar ett cirkulärt permuteras YFP-baserade dubbla excitation ratiometrisk kalcium sensor (ratiometrisk pericam-mt) selektivt uttrycks i mitokondrierna.
Dynamiska förändringar i intracellulär kalcium koncentration som svar på olika stimuli reglerar många cellulära processer såsom proliferation, differentiering och apoptos 1. Under apoptos, kalcium ackumuleras i mitokondrierna främjar frisättning av pro-apoptotiska faktorer från mitokondrier i cytosolen 2. Det är därför av intresse att direkt mäta mitokondrie kalcium i levande celler in situ under apoptos. Högupplöst fluorescerande avbildning av celler laddade med dubbla excitation ratiometrisk och icke-ratiometrisk syntetiska färgämnen kalcium Indikatorn har visat sig vara ett pålitligt och mångsidigt verktyg för att studera olika aspekter av intracellulär kalcium signalering. Mätning cytosoliskt kalcium flöden med hjälp av dessa tekniker är relativt enkelt. Att mäta intramitochondrial kalciumhalt i intakta celler med syntetiska kalcium indikatorer såsom Rhod-2 och Rhod-FF är mer utmanande. Syntetisk indikatorer riktade till mitokondrierna ha lindrat svar på repetitiva ökningar i mitokondriella kalcium, och störa mitokondriella morfologi 3. Dessutom syntetiska indikatorer tenderar att läcka ut från mitokondrier under flera timmar, vilket gör dem olämpliga för långtidsförsök. Därför har genetiskt kodade kalcium indikatorer baserade på grönt fluorescerande protein (GFP) 4 eller aequorin 5 riktade till mitokondrierna i hög grad underlättade mätningen av mitokondriell kalcium dynamik. Här beskriver vi en enkel metod för att i realtid mäta av mitokondriell kalcium flöden som svar på olika stimuli. Metoden är baserad på fluorescensmikroskopi av "ratiometrisk-pericam" som selektivt är riktad mot mitokondrier. Ratiometrisk pericam är en kalcium indikator bygger på en sammansmältning av cirkulärt permuterats gula fluorescerande protein och calmodulin 4. Bindningen av kalcium för att ratiometrisk pericam orsakar en förskjutning av excitation topp från 415 nm till 494 nm, medan spektrum, som toppar kring 515 nm, förblir oförändrad. Ratiometrisk pericam binder en enda kalcium jon med en dissociationskonstant in vitro på ~ 1,7 mikroM 4. Dessa egenskaper ratiometrisk pericam tillåter kvantifiering av snabba och långsiktiga förändringar i mitokondriernas kalcium koncentration. Dessutom beskriver vi anpassa denna metod till en standard brett fält kalcium imaging mikroskopet med vanliga filter set. Med hjälp av två olika agonister, den Purinergic agonist ATP och apoptos-inducerande läkemedel staurosporine, visar vi att denna metod är lämplig för att övervaka förändringar i mitokondriernas kalcium koncentration med en tidsupplösning av några sekunder till timmar. Dessutom visar vi också att ratiometrisk pericam är också användbart för att mäta mitokondriella fission / fragmentering under apoptos. Därför är ratiometrisk pericam särskilt väl lämpad för kontinuerlig och långsiktig mätning av mitokondrie kalcium dynamik under apoptos.
Här presenterar vi en mycket enkel metod för att mäta mitokondriella kalcium med hjälp av mitokondrie-riktade ratiometrisk pericam. Som framgår av Figur 1A, med vanliga widefield optik utan deconvolution är det möjligt att enkelt visa enskilda mitokondrier i HeLa celler med godtagbar signal-brus-förhållande. Detta beror på HeLa celler, liksom de flesta celler i kultur, platta ut avsevärt när anhängare undanröja behovet av konfokalmikroskopi eller annan specialutrustning. Vi har funnit liknande resultat i Jurkat celler följs poly-lysin belagda täckglas 8. I motsats till metoder med hjälp av färger, är det också möjligt att icke-invasivt övervaka mitokondrie kalciumnivåer i timmar med hjälp av genetiskt kodade kalcium indikatorer såsom ratiometrisk pericam (figur 1E). Detta är särskilt viktigt vid analys av mitokondrie-kalcium under celldöd. Dessutom är det också möjligt att visualisera fission / fragmentering av mitokondrier under apoptotiska processen. Som visas i figur 1D och E orsakar staurosporine behandling en långsam ökning av kalcium i välja delpopulationer av mitokondrier, som toppar på 20 minuter. Kalciumnivåer gå ner igen samtidigt med mitokondrie fragmenteringen innan man går upp igen två timmar efter behandlingen. Detta är förenligt med den långsamma vågor i cytosoliskt kalcium inducerad av staurosporine mäts behandling med Fura-2 9. Därmed kan viktiga kinetiska information erhållas som inte är möjligt med metoder som använder statiska mätningar. Även om vi har presenterat nyckeltal och inte halter kalcium i figur 1 är det möjligt att kalibrera sensorn på plats för att beräkna absoluta kalciumnivåer 4, 10. Ett viktigt förbehåll att tänka på är att ratiometrisk pericam är känslig för pH 4, 10. Eftersom både cytosoliskt och mitokondrie pH-nivån kan förändras dramatiskt under apoptos 11, är detta en viktig faktor. Titrering av pH i isolerade mitokondrier uttrycka pericam visa att öka [H +] ökar utsläppen av pericam när den exciteras vid 495 nm, med liten effekt på utsläppen stimuleras av excitation vid 410 nm, en egendom som har utnyttjats för att samtidigt mäta både mitokondrie kalcium och pH 12. Således selektivt övervakning av utsläpp med 410 nm magnetisering ger en möjlighet till icke-ratiometrically monitor mitokondrie kalcium med minskad oro för pH. Slutligen krävs det protokoll som presenteras här bara tillgång till en standard epifluorescent mikroskop med allmänt tillgängliga filter, vilket gör denna teknik tillgänglig för de flesta laboratorier.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Atsushi Miyawaki för att ge oss den ratiometrisk-pericam-mt uttryck konstruktion. Detta arbete stöddes av bidrag GM081685 från National Institutes of Health (DB).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. | |
Imaging Software | Molecular Devices, Inc | Metafluor | ||
Attofluor cell chamber | Invitrogen Corporation | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen Corporation | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies | |
MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen Corporation | M7512 |