Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen
Summary
Eine effiziente Methode, um hochreine lebensfähig meiotischen Fraktionen aus Maus Hoden zu erhalten, ist beschrieben, die vereint ein raffiniertes Zelle Dissoziation Protokoll mit fluoreszierenden activated cell sorting (FACS). Diese Methode nutzt die Unterschiede in der DNA-Gehalt und nukleare Dichte der diskreten meiotischen Fraktionen.
Abstract
Die Heterogenität der Zelltypen in den Hoden und das Fehlen von meiotischen Zellkultur-Modellen erhebliche Hürden für die Untersuchung der eindeutigen Unterscheidung Programme, die offenkundig sind während der Meiose worden. Zwei wesentliche Methoden wurden entwickelt, um zu reinigen, in unterschiedlichem Ausmaß, verschiedenen meiotischen Fraktionen von Erwachsenen und Jungtieren: Elutriation oder Staput (Sedimentation) mit BSA und / oder Percoll-Gradienten. Beide Methoden beruhen auf Zellgröße und Dichte zu trennen meiotischen Zellen 1-5. Insgesamt, abgesehen von wenigen Zellpopulationen 6, scheitern diese Protokolle, um eine ausreichende Reinheit der zahlreichen meiotischen Zellpopulationen, die für die detaillierte molekulare Analysen ergeben. Darüber hinaus mit solchen Methoden in der Regel eine Art von meiotischen Zellen können zu einer bestimmten Zeit, die eine zusätzliche Ebene der Komplexität in Bezug auf die Reproduzierbarkeit und Homogenität beim Vergleich meiotischen Zellproben fügt gereinigt werden.
Hier beschreiben wir eine raffinierte Methode, die man einfach visualisieren, zu identifizieren und zu reinigen meiotischen Zellen erlaubt, die aus Keimzellen zu runden Spermatiden, mit FACS mit Hoechst 33342 Färbung 7,8 kombiniert. Diese Methode bietet eine umfassende Momentaufnahme des gesamten meiotischen Prozess und ermöglicht es, hoch zu reinigen lebensfähige Zellen aus den meisten Stadium der Meiose. Diese gereinigten Zellen können dann im Detail für die molekulare Veränderungen, die Progression durch Meiose zu begleiten, zum Beispiel Veränderungen in der Genexpression 9,10 und die Dynamik der Nukleosomen Belegung an Hotspots der meiotischen Rekombination 11 analysiert werden.
Protocol
Discussion
Das Protokoll hier vorgestellte erlaubt es, gleichzeitig von ausgewachsenen männlichen Mäusen reinigen das gesamte Spektrum der meiotischen Phase-Zellen mit sehr hoher Reinheit, so dass Forscher, die Dynamik dieser grundlegenden Prozess zu studieren. Gereinigte Zellen können für zahlreiche Anwendungen von RNA-Extraktion 9,10, nucleosome Mapping 11, rekombinantes Molekül-Erkennung, Protein-Analysen und vieles mehr verwendet werden. Allerdings haben Nachweismethoden auf die Menge an meiotischen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde zum Teil durch Gelder aus dem Bundesstaat Florida, um Scripps und Vergabe Zahlen R01GM085079 und R21HD061304 vom National Institute of General Medical Sciences und dem National Institute of Child Health and Human Development, bzw. unterstützt. Dies ist Manuskript Nummer 20917 von The Scripps Research Institute.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Collagenase Type-1 | Worthington | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C | |
| Trypsin | Worthington | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C | |
| Hoechst 33342 | Arcos | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C | |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | ||
| 6″ Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
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