Эффективный метод получения высокоочищенного жизнеспособной мейоза фракций из семенников мышей описана, который сочетает в себе изысканный клеточной диссоциации протокол с люминесцентными активированный сортировки клеток (FACS). Этот метод использует различия в содержании ДНК и ядерной плотности дискретных мейоза фракций.
Гетерогенный характер типов клеток в яичках и отсутствие мейоза модели культуры клеток были значительные препятствия для изучения уникальных программ дифференциации, которые проявляются во время мейоза. Два основных метода были разработаны для очистки, в разной степени, различных фракций мейоза от взрослых, так и незрелых животных: отмучивания или Staput (осаждение) с помощью BSA и / или Перколла градиентов. Оба эти методы основаны на размер ячейки и плотности отдельных мейоза клетки 1-5. В целом, за исключением нескольких клеточных популяций 6, эти протоколы не сможет привести к достаточной чистоты многочисленные мейоза клеточных популяций, которые необходимы для подробного молекулярного анализа. Кроме того, с такими методами как правило, один тип мейоза клетки могут быть очищены в данный момент времени, который добавляет дополнительный уровень сложности в отношении воспроизводимости и однородности при сравнении образцов мейоза клетки.
Здесь мы описываем точный метод, который позволяет легко визуализировать, идентифицировать, очистить и мейоза клетки, из половых клеток в круглых сперматид, используя FACS в сочетании с Hoechst 33342 окрашивание 7,8. Этот метод обеспечивает общий снимок всего процесса мейоза и позволяет очистить высоко жизнеспособных клеток от большинства стадии мейоза. Эти очищенные клетки могут затем быть детально проанализированы для молекулярных изменений, которые сопровождают прогрессии через мейоз, например, изменения в экспрессии генов, 9,10 и динамика нуклеосом размещение в горячих точках мейотических рекомбинации 11.
Протокол, представленные здесь, позволяет одновременно очистить от взрослых самцов мышей весь спектр мейоза клетки сцене с очень высокой чистоты, что позволяет исследователям для изучения динамики этого фундаментального процесса. Очищенные клетки могут быть использованы для многоч?…
The authors have nothing to disclose.
Этот проект был поддержан частично денежные средства от штата Флорида в Scripps и наградить номера R01GM085079 и R21HD061304 из Национального Института общей медицинских наук и Национального института здоровья ребенка и развития человека, соответственно. Это рукописи номер 20917 из исследовательского института Скриппса.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Collagenase Type-1 | Worthington | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C | |
Trypsin | Worthington | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C | |
Hoechst 33342 | Arcos | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C | |
DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C | |
Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | ||
6″ Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |