En effektiv metod för att få renat livskraftiga meiotiska fraktioner från mus testiklarna beskrivs, som kombinerar en raffinerad cell dissociation protokoll med fluorescerande aktiverad cell sortering (FACS). Denna metod tar fördel av skillnader i DNA-innehåll och nukleära densiteten av diskreta meiotiska fraktioner.
Heterogena karaktär typer av celler i testiklarna och frånvaron av meiotiska modeller cellodling har varit betydande hinder för att studera den unika differentiering program som manifesteras under meios. Två huvudsakliga metoder har utvecklats för att rena, i varierande grad, olika meiotiska fraktioner från både vuxna och växande djur: elutriation eller Staput (sedimentering) med hjälp av BSA och / eller Percoll lutningar. Båda dessa metoder är beroende av cellens storlek och densitet för att separera meiotiska celler 1-5. Totalt sett, med undantag för några cellpopulationer 6, dessa protokoll inte ge tillräcklig renhet många meiotiska cellpopulationer som är nödvändiga för detaljerade molekylära analyser. Dessutom med sådana metoder oftast en typ av meiotiska celler kan renas vid en given tidpunkt, vilket ger en extra nivå av komplexitet vad avser reproducerbarhet och homogenitet när man jämför meiotiska cellprover.
Här beskriver vi en raffinerad metod som gör att man kan lätt visualisera, identifiera och rena meiotiska celler, från könsceller till runda spermatider, med hjälp av FACS kombination med Hoechst 33.342 färgning 7,8. Denna metod ger en övergripande bild av hela meiotiska processen och gör att man kan mycket rena livskraftiga celler från de flesta steg i meios. Dessa renas celler kan sedan analyseras i detalj för molekylära förändringar som följer med progression genom meios, till exempel förändringar i genuttryck 9,10 och dynamiken i nukleosomen beläggning på hotspots i meiotiska rekombination 11.
Protokollet presenteras här gör att man samtidigt rena från vuxna hanmöss hela sortimentet av meiotiska scenen celler med mycket hög renhet, vilket gör utredare för att studera dynamiken i denna grundläggande process. Renat celler kan användas för många tillämpningar, från RNA-extraktion 9,10, nukleosomen kartläggning 11, rekombinanta molekylen upptäckt, analyser protein och många fler. Men detektionsmetoder måste anpassas till den mängd meiotiska renat celler. I och med hög repr…
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt stöds delvis av pengar från delstaten Florida till Scripps och siffror utmärkelse R01GM085079 och R21HD061304 från National Institute of General Medical Sciences och National Institute of Child Health and Human Development, respektive. Detta manuskript antal 20.917 av The Scripps Research Institute.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Collagenase Type-1 | Worthington | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C | |
Trypsin | Worthington | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C | |
Hoechst 33342 | Arcos | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C | |
DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C | |
Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | ||
6″ Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |