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Biology

인간 신경 줄기 세포를 계산

doi: 10.3791/262 Published: August 22, 2007

Summary

가능한 세포의 정확한 수를 지식은 많은 조직 문화 조작이 필요합니다. 이 프로토콜은 살고 죽은 세포 사이의 차별과 hemacytometer를 사용하여 세포를 계량하는 방법에 대해 설명합니다. 그것이 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 계산 설명하지만, 그것은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다.

Abstract

세포 현탁액의 주어진 볼륨에서 가능한 세포의 정확한 개수의 지식은 이러한 immunocytochemistry 또는 셀 transfections에 대한 도금 세포 많은 일상적인 조직 문화의 조작을 위해 필요합니다. 이 프로토콜은 살고 죽은 세포 사이의 차별과 세포 농도와 hemacytometer를 사용하여 전체 휴대폰 번호를 quantifying 위해 간단하고 빠른 방법을 설명합니다. 이 절차는 먼저 성장 표면에서 세포를 분리 및 미디어에서 그들을 resuspending 필요합니다. 다음, 전지 Trypan 파랑 (이상 사분면마다 20-50 세포를 줄 수있는 농도)의 용액에 희석하여 hemacytometer에 배치됩니다. 마지막으로, 한 1mm 2 사분면 (0.1 μl)와 희석 계수 곱한의 볼륨에 의해 평균 나누어 여러 무작위로 선택된 quadrants에서 가능한 세포의 수를 평균하면 나도 당 세포의 숫자를 제공합니다 μl의 전체 볼륨을하여 세포 농도를 곱한하면 전체 휴대폰 번호를 제공합니다. 이 프로토콜은 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 계산 설명뿐만 아니라, 많은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다.

Protocol

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인간 신경 줄기 세포를 Passaging

참고 : 참조하십시오 Passaging 인간 신경 줄기 세포의 세포를 분리하고 resuspend하는 방법에 대한 기사. http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263

카운팅에 대한 세포 현탁액을 준비

  1. 0.4 % Trypan 블루 솔루션과 eppendorf 튜브에 세포 미디어 20 μl 장소 25 μl.
  2. 부드럽게 동질적인 중지를 만드는 미디어 알려진 볼륨에있는 세포가 들어있는 튜브를 감청하여 계산하는 세포를 Resuspend. eppendorf 튜브 이전 단계에서 세포로의 5 μl를 놓습니다. 이 단계는 10의 요인에 의해 세포 농도 dilutes.
  3. hemacytometer에 덮개 유리를 삽입하고, 세포 현탁액의 11-12 μl에 대한로드합니다.

    262_Figure - 01

Hemacytometer의 세포를 계산

  1. 위상 대조 현미경에 hemacytometer의 전체 격자를 관찰. 그리드 중 하나 사분면 (예 : 빨간색 하나)에 중점을두고 있습니다.

    262_Figure - 02

  2. 자신의 멤브레인 손상 및 Trypan 파란색 염료를 제외 수 없습니다 되었기 때문에 죽었거나 죽어가는 세포는 파란색으로 나타납니다. 가능한 세포는 파란색으로 표시되지 않습니다과 위상 대조에 빛나는 "헤일로"( "위상 밝은"됩니다)에 둘러싸여 것입니다.
  3. 한 사분면 (지역 1mm 2) 가능한 세포의 수를 계산합니다. 당신은 또한 세포의 총 숫자로 가능한 세포의 수를 나누어 세포 생존을 결정할 수 있습니다. 3-4 무작위 quadrants의 세포를 카운트하고 사분 당 세포의 평균 개수를 결정합니다. 사분면의 볼륨이 10 -4 ML 또는 0.1 μl 것으로 알려져 있기 때문에, 세포의 농도는 결정 수 있습니다


    262_Figure - 03


  4. 당신은 # 전지 / μl를 결정하기 위해 다음과 같은 바로 가기를 사용할 수 있습니다 :

    262_Figure - 04

    튜브 # 튜브에 세포의 총 = # 전지 / μl X μl

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Discussion

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이 프로토콜은 세포를 포함하는 실험의 다양한 세포 농도를 결정하기 위해 간단한 신속한 방법을 설명합니다. 3D에서 설명하는 바로 가기를 사용하여, 하나는 신속하고 정확하게 세포 농도와 주어진 볼륨에서 전체 휴대폰 번호를 확인할 수 있습니다.

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Acknowledgments

저자는 어린이의 병원, hNSPC 문화를 제공하는 오렌지 카운티 연구소 국립 인간 신경 줄기 세포 자원의 박사 필립 H. 슈워츠을 인정하고 싶습니다.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Phase Contrast Hemacytometer Tool Hausser Scientific 02-671-54 Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Trypan Blue Stain 0.4% Reagent GIBCO, by Life Technologies 15250-061 Distributed by Invitrogen under the indicated catalog #

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References

  1. Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
  2. Caprette, D. avidR. Using a Hemacytometer. BioEd Online. http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3 (2008).
  3. Caprette, D. avidR. Counting Chamber (Hemacytometer). BioEd Online. http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2 (2008).
인간 신경 줄기 세포를 계산
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Marchenko, S., Flanagan, L. Counting Human Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (7), e262, doi:10.3791/262 (2007).More

Marchenko, S., Flanagan, L. Counting Human Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (7), e262, doi:10.3791/262 (2007).

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