Summary
نحن تصف وضع بروتوكول لمراقبة وتحليل الخلية المسارات المتداول على ركائز مستقبلات نقوش غير المتماثلة. البيانات الناتجة هي مفيدة للهندسة من مستقبلات منقوشة ركائز للتسمية خالية من فصل الخلية وتحليلها.
Abstract
النزوح الأفقي للخلايا متعامدة مع تدفق سيل من قبل المتداول على أنماط مستقبلات غير المتناظر فرصة لتطوير أجهزة جديدة لفصل التسمية حرة وتحليل الخلايا 1. قد تستخدم مثل هذه الأجهزة التهجير الوحشي المستمر لتدفق الانفصال ، أو أنماط المستقبلات التي تعدل التصاق للتمييز بين الظواهر أو مستويات مختلفة من الخلايا مستقبلات التعبير. فهم طبيعة المسارات المتداول على الخلية المستقبلة للنمط ركائز ضرورية للهندسة من ركائز وتصميم مثل هذه الأجهزة.
هنا ، علينا أن نظهر بروتوكول لدراسة مسارات المتداول على أنماط الخلية المستقبلة غير المتماثلة التي تدعم التصاق الخلية المتداول 2. ملفقة واضحة المعالم ، ميكرومتر النطاق أنماط ف selectin الطباعة باستخدام مستقبلات microcontact على الذهب المطلي الشرائح التي تم دمجها في غرفة التدفق. وقد تدفقت HL60 الخلايا معربا عن يجند PSGL - 1 3 عبر حقل من خطوط منقوشة وتصور على مجهر حقل مشرق مقلوب. الخلايا وتدحرجت على طول حواف مجنزرة يميل للأنماط ، مما أدى إلى انحراف الجانبي 1. كل خلية عادة تدحرجت لمسافة معينة على طول حواف نمط (كما هو موضح على حافة طول التعقب) ، فصل من الحافة ، ونمط reattached إلى المصب. رغم أن هذا الانفصال يجعل من الصعب تتبع مسار كامل من خلية من مدخل للخروج في غرفة التدفق ، وكانت تستخدم الجسيمات لتتبع برامج لتحليل والعائد على مسارات المتداول من الخلايا خلال الوقت عندما كانت تتحرك على مستقبل واحد نقوش الخط. ثم تم فحص مسارات للحصول على توزيعات السرعات المتداول الخلية وأطوال حافة تتبع لكل خلية لأنماط مختلفة.
هذا البروتوكول هو مفيد لقياس مسارات المتداول على أنماط الخلية المستقبلة وتتعلق هذه المعايير الهندسية لمثل زاوية نمط وإجهاد القص. وسوف تكون هذه البيانات مفيدة لتصميم الأجهزة ميكروفلويديك لتسمية خالية من فصل الخلية وتحليلها.
Protocol
1. HL60 الخلية المتداول
1.1. تلفيق ركائز منقوشة.
- الطباعة باستخدام microcontact (μCP) 4-7 لجعل التناوب الذاتي تجميعها monolayers (صواريخ سام) من جزيئات الربط على الشرائح الزجاجية المطلية بالذهب : افتعال microcontact الطباعة polydimethylsiloxane (PDMS) الطوابع التي تحدد أنماط مستقبلات بزاوية ميل 10 = α ° قبل SU - 8 عملية صب. تنظيف السطح الذهب مع حل البيرانا (3:1 مزيج من حمض الكبريتيك إلى 30 ٪ بيروكسيد الهيدروجين) لمدة 20 دقيقة ثم يشطف والسطح مع الماء DI غزير ب 24.5 درجة مئوية قبل الاستخدام. حبر الطابع PDMS بمحلول PEG 5mM في الايثانول. الطابع الجاف في الهواء لمدة 20 دقيقة. بلطف وضع الطابع على سطح الذهب لمدة 40 ثانية وتأكد من وجود اتصال جيد بين السطح وختم الذهب. لا يلزم الضغط الزائد. شطف السطح مع الإيثانول والجافة وتحت سيل من N 2.
- احتضان الركيزة داخل ف selectin حل (15 ميكروغرام / مل في DPBS) باستخدام غرفة التروية (علوم المجهر الإلكتروني) لمدة 3 ساعات ب 24.5 درجة مئوية إلى نمط بقية المناطق مع selectin ف. شطف السطح مع DPBS غزير.
- الردم السطح مع جيش صرب البوسنة (1 ملغ / مل في DPBS) لمدة 1 ساعة لمنع التفاعلات غير محددة. شطف السطح مع DPBS غزير.
1.2. تجارب الخلايا المتداول في الدائرة التدفق.
- تدفق تعليق HL60 الخلايا (~ 10 5 خلية / مل) على أسطح منقوشة في غرفة مستطيلة تدفق (Glycotech ، المؤتمر الوطني العراقي ؛ العرض ث = 1.0 سم ، الطول = 6 سم ، ارتفاع ح = 0.0127 سم) بلغ 24.5 درجة مئوية. استخدام مضخة الحقن (الآلات الدقيقة العالمي ، SP230IW) لتوليد معدل التدفق من 75 ميكرولتر / دقيقة ، مع إجهاد القص المقابلة نحو 0.5 DYN / سم 2 (~ 0.05 باسكال). حساب إجهاد القص τ باستخدام معادلة تدفق Poiseuille الطائرة τ = 6μQ/wh 2 ، حيث μ هي اللزوجة الحركية (0.001002 باسكال ق) ، وسؤال هو معدل التدفق الحجمي ، ث هو عرض للغرفة التدفق ، وح هو ذروة غرفة التدفق.
- استخدام المجهر المقلوب (نيكون TE2000 - U) مع كاميرا محمولة (Andor iXon 885) لتسجيل HL60 المتداول الخلايا والتفاعلات مع ركائز ف selectin باستخدام لاصق 4 × الهدف ، وعادة بمعدل 1 إطار في الثانية لفترات من 300 س. إجراء ثلاث تجارب مستقلة ، لكل درجة إجهاد القص ونمط زاوية الميل. البيانات بوصفها انحرافا يعني ومستوى متوسط القيم التي تم الحصول عليها من كل تجربة.
- تحليل البيانات.
تحليل تسلسل الصور بواسطة برنامج مخصص (Mathworks ، وشركة) مطلب التي تستخدم الجسيمات تتبع 8 مجانية لتوليد المسارات على طول خط منقوشة الحواف. ويتم اختيار المسارات تمتد حتى نهاية عصابة ف selectin ومزودة جزأين خط مستقيم -- واحدة متحالفة مع تدفق ، والأخرى المتحالفة مع حافة النمط. ثم يتم استخدام هذه الشرائح اثنين إلى حساب طول حافة تتبع ، المتداول السرعة على الحافة ، والمتداول السرعة على المنطقة عادي.
2. ممثل النتائج :
الشكل (أ) تبين واحدة من الصور مجهر تحويل من الفيديو من التفاعلات HL60 المتداول مع ركائز ف selectin لاصقة به هدفا × 4. المناطق المضيئة والمظلمة تقابل ف selectin مستقبلات PEG والمناطق ، على التوالي. الشكل (B) ويبين المسارات التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج ماتلاب المخصصة. كانت زاوية الميل 10 درجة وحافة التوتر والقص DYN 0.5 / سم 2. موصوفة طول حافة تتبع ، ل ه ، والتشريد ، د ، والسرعات المتداول على حافة وداخل العصابات ، والخامس ه ع الخامس على التوالي ، في الشكل (C - 1). الشكل (C - 2) ويبين التوزيع (عدد الخلايا مسجل) تتبع طول الحافة. Insets تظهر متوسط قيمة ل ه وسرعة المتداول على حافة (V ه) وداخل نطاقات (V ع) في زاوية الميل α = 10 درجة وحجم السائل إجهاد القص نحو 0.5 DYN / سم 2 أشرطة الخطأ تمثل واحدة في قيمة الانحراف المعياري ، حيث n = 3 تكرار التجارب (3 الأسطح تكرار) لكل حالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وصفت لنا بروتوكول لدراسة الخلية المسارات المتداول على السطوح مستقبلات منقوشة غير المتماثلة ملفقة باستخدام الطباعة microcontact 2. ويمكن استخدام هذه الصور لسطح المجهر الضوئي منقوشة يظهر التباين واضحا بين المناطق وPEG ف selectin لتأكيد ما إذا ختم بنجاح. ويمكن ملاحظة حادة ، وحواف مستقيمة عندما يتم تنفيذ ختم جيدا. قد يضغط بشدة من الطوابع نتيجة تشوه في الطابع الذي يحد من دقة النقوش. ويمكن الحصول على حواف متموجة عند تركيز حبر عالية جدا أو ختم الوقت طويل جدا. الاتصال السيئة بين الطابع والسطح يؤدي إلى أنماط PEG غير موحدة عندما يكون حجم الطابع صغير جدا (<0.5 سم 2). يجوز لغير العذبة نتيجة حل الحبر في الخلايا المتجددة على المناطق PEG نقوش بسبب انخفاض قدرة إيقاف فاعلية ف selectin. ويمكن حساب زاوية الميل الفعلي من الصور من نمط ومسارات تدفق الخلايا الحرة التي لا تتفاعل مع السطوح. ووصف التجربة هنا يعطي معلومات حول الخلية الفردية المتداول على طول حواف نمط الأحداث ، ومع ذلك ، فإنه من الصعب تتبع تلقائيا الخلايا التي فصل على نمط واحد وعلى نمط آخر إعادة نعلق. تغيير نمط تباعد ، على سبيل المثال ، قد تمكن من تتبع خلية واحدة تواجه حواف متعددة. هذه القدرة يمكن تمكين دقة أعلى للتمييز بين الخلايا المتجددة مع مختلف الخصائص على مستوى خلية واحدة. وسلوك الخلية يعتمد على المتداول يغاندس على الخلية ، ونحن نفترض أن مثل هذه التجارب قد تمكن من تصميم أنماط مناسبة لفصل الظواهر مختلفة من الخلايا على أساس الاختلافات في سلوكهم المتداول 3 ، 12/09. يمكن لهذا العمل يكون من المفيد لتصميم أجهزة لفصل الخلايا والتحليل القائم على التفاعل بين الخلايا ويغاندس المستقبلات منقوشة غير المتماثلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد أيد هذا المشروع من قبل المركز ديشباندي الابتكار التكنولوجي في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (RK وJMK) وجائزة التوظيف لجبهة الخلاص الوطني 0952493 RK خلال الكيميائية والبيولوجية برنامج فصل الألوان. نشكر معهد التكنولوجيا النانوية الجندي (ISN) ومختبر التكنولوجيا مايكروسيستمز (MTL) في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا لاستخدام مرافقها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human promyelocytic leukemia cells | ATCC | CCL-240 | HL60 cells |
| Gold-coated glass slides | EMF | TA134 | Gold slides |
| (1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | PEG |
| Recombinant human P-selectin | R&D Systems | ADP3-050 | P-selectin |
| Bovine serum albumin | Rockland Immunochemicals | BSA-50 | BSA |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Mediatech, Inc. | 21-030 | DPBS |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 316989 |
References
- Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors. Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).
- Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns. Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).
- Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1. Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).
- Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H.
- James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing. Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).
- Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers. Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).
- Matlab Particle Tracking. , Avaliable from: http://physics.georgetown.edu/matlab/ Forthcoming.
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 Forthcoming.
- Greenberg, A. W., Hammer, D. A. Cell separation mediated by differential rolling adhesion. Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).
- Higuchi, A., Tsukamoto, Y. Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).
- Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. Patterned surfaces segregate compliant microcapsules. Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).
