Summary
हम निरीक्षण करने के लिए और असममित रिसेप्टर नमूनों substrates पर सेल रोलिंग trajectories विश्लेषण प्रोटोकॉल का वर्णन. परिणामी डेटा लेबल से मुक्त सेल जुदाई और विश्लेषण के लिए रिसेप्टर नमूनों substrates के इंजीनियरिंग के लिए उपयोगी होते हैं.
Protocol
1. HL60 रोलिंग सेल
1.1. नमूनों Substrates के निर्माण कार्य.
- Microcontact (μCP) मुद्रण 4-7 का उपयोग करने के लिए सोने लेपित गिलास स्लाइड पर खूंटी अणुओं के आत्म इकट्ठे monolayers (SAMs) बारी बनाने: microcontact मुद्रण polydimethylsiloxane (PDMS) टिकटों कि α = 10 के झुकाव कोण के साथ रिसेप्टर पैटर्न परिभाषित बनाना एक SU-8 ढलाई की प्रक्रिया के द्वारा °. पिरान्हा समाधान (सल्फ्यूरिक एसिड के 03:01 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड मिश्रण) के साथ 20 मिनट के लिए सोने की सतह को साफ करें और फिर प्रचुर डि पानी के साथ 24.5 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करने के लिए पूर्व सतह कुल्ला. इथेनॉल में 5mm खूंटी समाधान के साथ PDMS स्टाम्प इंक. 20 मिनट के लिए हवा में स्टांप सूखी. सोने की सतह पर धीरे 40 सेकंड के लिए टिकट और डाल सुनिश्चित करें कि वहाँ सोने की सतह और स्टांप के बीच एक अच्छा संपर्क है. कोई अतिरिक्त दबाव की आवश्यकता है. इथेनॉल के साथ सतह कुल्ला और यह 2 एन के एक धारा के तहत शुष्क .
- पी selectin (15 DPBS में μg / एमएल) समाधान 3 घंटे के लिए 24.5 पर छिड़काव चैम्बर (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान) ° पैटर्न के लिए सी पी selectin के साथ शेष क्षेत्रों का उपयोग कर के भीतर सब्सट्रेट सेते प्रचुर DPBS के साथ सतह कुल्ला.
- Backfill BSA (1 / DPBS में मिलीग्राम एमएल) के साथ 1 ज के लिए सतह गैर विशिष्ट बातचीत ब्लॉक करने के लिए. प्रचुर DPBS के साथ सतह कुल्ला.
1.2. सेल फ्लो चैंबर में प्रयोगों रोलिंग.
- एक आयताकार प्रवाह चैम्बर में नमूनों सतहों पर HL60 कोशिकाओं (~ 10 5 कोशिकाओं / एमएल) (; चौड़ाई w = 1.0 सेमी, लंबाई = 6 सेमी; Glycotech, इंक ऊंचाई घंटे = ०.०१२७ सेमी) के निलंबन प्रवाह 24.5 पर डिग्री सेल्सियस एक सिरिंज पंप (विश्व परिशुद्धता उपकरण, SP230IW) का प्रयोग 75 μL / मिनट के प्रवाह की दर उत्पन्न dyn के 0.5 / 2 सेमी (~ 0.05 पा) के आसपास इसी कतरनी तनाव के साथ. विमान Poiseuille प्रवाह समीकरण τ = 6μQ/wh 2, जहां μ कीनेमेटीक्स चिपचिपापन (0.००१००२ पा ओं), क्यू बड़ा प्रवाह की दर का उपयोग करके τ कतरनी तनाव की गणना करने के लिए, w प्रवाह कक्ष की चौड़ाई है, और घंटे की ऊंचाई है प्रवाह चैम्बर.
- एक घुड़सवार कैमरे के लिए (Andor iXon 885) HL60 चिपकने वाला पी selectin एक 4 का उपयोग substrates के साथ बातचीत रोलिंग कोशिकाओं रिकॉर्ड × उद्देश्य के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप (यू Nikon - TE2000) का प्रयोग करें, 300 के durations के लिए आम तौर पर 1 फ्रेम प्रति सेकंड की दर पर एस तीन प्रत्येक कतरनी तनाव परिमाण और पैटर्न झुकाव कोण के लिए स्वतंत्र प्रयोगों प्रदर्शन करना. औसत प्रत्येक प्रयोग से प्राप्त मान का मतलब और मानक विचलन के रूप में वर्तमान डेटा.
- डेटा विश्लेषण.
एक स्वनिर्धारित Matlab (Mathworks, Inc,) प्रोग्राम है कि एक 8 फ्रीवेयर ट्रैकिंग कण नमूनों लाइन किनारों के साथ पटरियों उत्पन्न उपयोग के द्वारा छवि दृश्यों का विश्लेषण. पी selectin बैंड के अंत तक विस्तार ट्रैक्स का चयन और दो सीधी रेखा क्षेत्रों के साथ लगे - प्रवाह के साथ गठबंधन है, पैटर्न बढ़त के साथ गठबंधन अन्य. इन दो क्षेत्रों को फिर बढ़त ट्रैकिंग लंबाई की गणना करने के लिए किनारे पर रोलिंग वेग, और सादे क्षेत्र पर वेग रोलिंग करने के लिए उपयोग किया जाता है.
2. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्र (A) चिपकने वाला पी selectin substrates के साथ एक 4 × उद्देश्य का उपयोग HL60 रोलिंग बातचीत के वीडियो से परिवर्तित माइक्रोस्कोप छवियों के एक से पता चलता है. उज्ज्वल और अंधेरे क्षेत्रों पी selectin रिसेप्टर और खूंटी क्षेत्रों के अनुरूप, क्रमशः चित्रा (बी) एक स्वनिर्धारित Matlab कार्यक्रम का उपयोग कर प्राप्त पटरियों से पता चलता है.. बढ़त झुकाव कोण 10 ° और कतरनी तनाव 0.5 dyn के / 2 सेमी था. बढ़त ट्रैकिंग लंबाई, एल ई, विस्थापन, घ, और किनारे पर और बैंड, वी और ई वी पी, क्रमशः के अंदर रोलिंग वेग, चित्रा में वर्णित हैं (सी -1) चित्रा को दिखाती हैं ( सी -2) बढ़त ट्रैकिंग लंबाई के वितरण (दर्ज कोशिकाओं की संख्या). Insets एल ई और किनारे पर रोलिंग वेग (ए वी) के औसत मूल्य दिखाने के और झुकाव कोण पर बैंड (वी पी) के अंदर α = 10 ° और dyn के 0.5 / 2 सेमी के आसपास द्रव कतरनी तनाव परिमाण. त्रुटि सलाखों के एक मानक विचलन, जहाँ n = प्रत्येक शर्त के लिए 3 को दोहराने के प्रयोगों (3 को दोहराने के सतहों). प्रतिनिधित्व करते हैं
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Discussion
हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन है असममित रिसेप्टर नमूनों microcontact 2 मुद्रण का उपयोग करने के लिए गढ़े सतहों पर सेल रोलिंग trajectories की जांच करने के लिए. नमूनों खूंटी और पी selectin क्षेत्रों के बीच स्पष्ट विपरीत दिखा सतह के ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवियों पुष्टि करते हैं कि क्या मुद्रांकन सफल रहा है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तीव्र, सीधे किनारों मनाया जा सकता है जब मुद्रांकन अच्छी तरह से किया जाता है कर सकते हैं. हार्ड स्टांप का उपयोग स्टांप विरूपण जो पैटर्न की परिशुद्धता की सीमा में परिणाम सकता है. लहराती किनारों प्राप्त हो सकता है जब स्याही की एकाग्रता बहुत अधिक है या मुद्रांकन समय बहुत लंबा है हो सकता है. टिकट और सतह के बीच बुरा संपर्क गैर वर्दी खूंटी पैटर्न होता है जब टिकट के आकार बहुत छोटा (<0.5 2 सेमी) है. गैर ताजा स्याही समाधान कमी पी selectin passivate करने की क्षमता की वजह से खूंटी नमूनों क्षेत्रों पर रोलिंग कोशिकाओं में परिणाम सकता है. वास्तविक झुकाव कोण पैटर्न और मुक्त बह कोशिकाओं है कि सतहों के साथ नहीं बातचीत कर रहे हैं के trajectories के छवियों से गणना की जा सकती है. प्रयोग पैदावार व्यक्तिगत सेल रोलिंग पैटर्न किनारों के साथ घटनाओं के बारे में जानकारी यहाँ वर्णित है, तथापि, यह मुश्किल है के लिए स्वचालित रूप से कोशिकाओं है कि एक ही पैटर्न पर अलग और एक और पैटर्न पर फिर से संलग्न ट्रैक. पैटर्न रिक्ति को बदलना, उदाहरण के लिए, एक एकल एकाधिक किनारों का सामना सेल ट्रैकिंग सक्षम हो सकता है. इस क्षमता एकल कोशिका के स्तर पर अलग अलग विशेषताओं के साथ रोलिंग कोशिकाओं के बीच भेद करने के लिए उच्च संकल्प सक्षम हो सकता है. के रूप में सेल रोलिंग व्यवहार सेल पर ligands पर निर्भर करता है, तो हम परिकल्पना है कि ऐसे प्रयोगों उपयुक्त पैटर्न के डिजाइन के लिए अलग अलग सेल अपने रोलिंग तीन व्यवहार, 12/09 में मतभेद पर आधारित phenotypes सक्षम हो सकता है. यह काम इस तरह के उपकरणों की सेल जुदाई और विश्लेषण सेल ligands और नमूनों असममित रिसेप्टर्स के बीच बातचीत पर आधारित के लिए डिजाइन के लिए उपयोगी हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस परियोजना एमआईटी में देशपांडे केंद्र (आर और JMK) तकनीकी नवाचार के लिए और NSF कैरियर 0952493 पुरस्कार के लिए रासायनिक और जैविक Separations कार्यक्रम के माध्यम से आर.के. द्वारा समर्थित किया गया था. हम सैनिक Nanotechnologies (ISN) और एमआईटी माइक्रोसिस्टम्स प्रौद्योगिकी प्रयोगशाला (MTL) उनकी सुविधाओं का उपयोग करने के लिए के लिए संस्थान धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human promyelocytic leukemia cells | ATCC | CCL-240 | HL60 cells |
| Gold-coated glass slides | EMF | TA134 | Gold slides |
| (1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | PEG |
| Recombinant human P-selectin | R&D Systems | ADP3-050 | P-selectin |
| Bovine serum albumin | Rockland Immunochemicals | BSA-50 | BSA |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Mediatech, Inc. | 21-030 | DPBS |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 316989 |
References
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