Summary
Beschrijven we een protocol om te observeren en cel-rollen trajecten te analyseren op asymmetrische receptor-patroon substraten. De resulterende gegevens zijn nuttig voor de engineering van receptor-patroon substraten voor label-free cell scheiding en analyse.
Abstract
Zijdelingse verplaatsing van cellen loodrecht op een stroom stroom door walsen op asymmetrische receptor patronen biedt een gelegenheid voor de ontwikkeling van nieuwe apparaten voor de label-free scheiding en analyse van cellen 1. Dergelijke apparaten kunnen gebruik maken van zijdelingse verplaatsing voor continue-flow scheiding, of receptor patronen die hechting moduleren om onderscheid te maken tussen de verschillende cel fenotypes of niveaus van receptor expressie. Begrijpen van de aard van de cel rollen trajecten op receptor-patroon substraten is noodzakelijk voor de engineering van de substraten en het ontwerp van dergelijke apparaten.
Hier tonen we een protocol voor het bestuderen van cellen rollen trajecten op asymmetrische receptor patronen die cel rollen adhesie 2 ondersteunen. Goed gedefinieerde, um-schaal patronen van P-selectine-receptoren werden vervaardigd met behulp van microcontact afdrukken op goud gecoate dia's die werden opgenomen in een flow kamer. HL60 cellen die de PSGL-1-ligand 3 werden stroomde over een gebied van de patroon lijnen en gevisualiseerd op een omgekeerde helder veld microscoop. De cellen gerold en gevolgd langs de schuine randen van de patronen, wat resulteert in een zijwaartse afbuiging. Elke cel meestal van staal voor een bepaalde afstand langs de randen patroon (gedefinieerd als de rand tracking lengte), los van de rand, en opnieuw aan een downstream patroon. Hoewel dit detachement maakt het moeilijk om volgen het gehele traject van een cel van de ingang af te sluiten in de stroom kamer, was particle-tracking-software gebruikt om te analyseren en de glooiende trajecten van de cellen opbrengst in de tijd toen ze bewegen op een enkele receptor -patroon lijn. De trajecten werden vervolgens onderzocht op uitkeringen van cel-rollen snelheden en de rand tracking lengtes voor elke cel voor verschillende patronen te verkrijgen.
Dit protocol is handig voor het kwantificeren van cel-rollen trajecten op de receptor patronen en met betrekking tot deze technische parameters zoals hoek van het patroon en de shear stress. Deze gegevens zal nuttig zijn voor het ontwerp van microfluïdische apparaten voor het label-free cell scheiding en analyse.
Protocol
1. HL60 cellen rollen
1.1. Fabricage van Patterned Substrates.
- Met behulp van microcontact afdrukken (μCP) 4-7 te maken afwisselend zelf-geassembleerde monolagen (SAM) van de PEG-moleculen op de goud gecoate glas dia's: Vervaardig microcontact afdrukken polydimethylsiloxaan (PDMS) postzegels, dat de receptor patronen gedefinieerd met hellingshoek van α = 10 ° door een SU-8 molding proces. Reinig het oppervlak met goud piranha-oplossing (3:1 mengsel van zwavelzuur tot 30% waterstof peroxide) gedurende 20 minuten en daarna het oppervlak afspoelen met overvloedig DI water bij 24,5 ° C voor gebruik. Inkt van de PDMS stempel met 5mm PEG-oplossing in ethanol. Droog de stempel in de lucht gedurende 20 minuten. Voorzichtig zet de stempel op de gouden oppervlak voor 40 sec en zorg ervoor dat er een goed contact tussen de goud-oppervlak en de stempel. Geen overdruk nodig is. Spoel het oppervlak met ethanol en drogen onder een stroom van N 2.
- Incubeer de ondergrond binnen de P-selectine-oplossing (15 ug / ml in DPBS) met behulp van een perfusie kamer (Electron Microscopy Sciences) gedurende 3 uur bij 24,5 ° C tot patroon van de resterende gebieden met P-selectine. Spoel het oppervlak met overvloedig DPBS.
- Backfill het oppervlak met BSA (1 mg / ml in DPBS) gedurende 1 uur voor niet-specifieke interacties te blokkeren. Spoel het oppervlak met overvloedig DPBS.
1.2. Cel Rolling Experimenten in een Flow Kamer.
- Stroom een suspensie van HL60 cellen (~ 10 5 cellen / ml) over de oppervlakken met een patroon in een rechthoekige stroom kamer (Glycotech, Inc; breedte w = 1,0 cm, lengte = 6 cm, hoogte h = 0,0127 cm) bij 24,5 ° C. Gebruik een injectiepomp (World precisie-instrumenten, SP230IW) om het debiet van 75 pL / min te genereren, met bijbehorende shear stress rond 0,5 dyn / cm 2 (~ 0,05 Pa). Bereken schuifspanning τ door gebruik te maken van het vliegtuig Poiseuille stroming vergelijking τ = 6μQ/wh 2, waar μ is de kinematische viscositeit (0,001002 Pa s), Q is volumestroom, w is de breedte van de stroom kamer, en h is de hoogte van de doorstroming kamer.
- Gebruik een omgekeerde microscoop (Nikon TE2000-U) met een gemonteerde camera (Andor IXON 885) tot HL60 cellen rollende interacties met lijm P-selectine substraten met behulp van een 4 × plaat doel, meestal met een snelheid van 1 beeld per seconde voor de duur van 300 s. Uitvoeren van drie onafhankelijke experimenten, voor elke shear stress omvang en het patroon kantelhoek. Huidige gegevens als gemiddelde en standaarddeviatie van de gemiddelde waarden die zijn verkregen van elk experiment.
- Data Analysis.
Analyseer de afbeelding sequenties door een op maat gemaakte Matlab (Mathworks, Inc) programma dat een deeltje tracking freeware 8 tot en met tracks te genereren langs de lijn patroon randen gebruikt. Tracks verlengen tot het einde van een P-selectine band worden geselecteerd en voorzien van twee rechte lijn segmenten - een lijn met de stroom mee, de andere lijn met het patroon rand. Deze twee segmenten worden vervolgens gebruikt om de rand tracking lengte te berekenen, rollen snelheid op de rand, en de rollen snelheid op de vlakte regio.
2. Representatieve resultaten:
Figuur (A) toont een van de microscoop beelden omgezet van de video van HL60 rollende interacties met lijm P-selectine substraten met behulp van een 4 × doelstelling. Heldere en donkere gebieden overeenkomen met P-selectine receptor en PEG regio's, respectievelijk. Figuur (B) toont de sporen verkregen met behulp van een aangepaste Matlab-programma. De rand hellingshoek is 10 ° en de shear stress was 0.5 dyn / cm 2. De rand tracking lengte, l e, verplaatsing, d, en de rollende snelheden op de rand en in de banden, V en V e p, respectievelijk, worden beschreven in figuur (C-1). Figuur (C-2) geeft de verdeling (van het aantal geregistreerde cellen) van de rand van tracking lengte. Inzetstukken geven de gemiddelde waarde van l e en de glooiende snelheid op de rand (V e) en binnen de band (V p) op de hoek van α = 10 ° en de vloeistof schuifspanning magnitude ongeveer 0,5 dyn / cm 2. Foutbalken vertegenwoordigen een standaardafwijking, waarbij n = 3 repliceren experimenten (3 repliceren oppervlakken) voor elke conditie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben beschreven een protocol naar cel rollen trajecten te onderzoeken op asymmetrische receptor-oppervlakken met een patroon vervaardigd met behulp van microcontact afdrukken 2. De optische microscoop beelden van de patroon oppervlak van een duidelijke tegenstelling tussen de PEG en P-selectine gebieden kan worden gebruikt om te bevestigen of stempelen succesvol is. Scherpe, rechte kanten kan worden waargenomen wanneer de afstempeling goed wordt uitgevoerd. Hard drukken van de stempel kan resulteren in stempel vervorming die de precisie van patronen grenzen. Golvende randen kunnen worden verkregen wanneer de inkt concentratie te hoog is of het stampen is te lang. Slecht contact tussen de stempel en de oppervlakte leidt tot niet-uniforme PEG patronen wanneer de grootte van de stempel is te klein (<0,5 cm 2). Niet-verse inkt oplossing kan resulteren in cellen rollen op de PEG-patroon regio's als gevolg van verminderd vermogen tot het P-selectine passiveren. De werkelijke hellingshoek kan worden berekend op basis van beelden van het patroon en de trajecten van free-flowing cellen die niet zijn interactie met de oppervlakken. Het hier beschreven experiment levert informatie over de individuele cel rollen evenementen langs patroon randen, maar het is moeilijk om automatisch te volgen cellen die los op een patroon en opnieuw bevestigen op een ander patroon. Veranderen van het patroon afstand, bijvoorbeeld, kan de tracering van een enkele cel tegenkomen meerdere randen. Dit vermogen staat kan stellen hogere resolutie voor onderscheid te maken tussen cellen met verschillende rollen kenmerken op de enkele cel niveau. Als cel rollen gedrag is afhankelijk van de liganden op de cel, we veronderstellen dat dergelijke experimenten kan het ontwerpen van passende patronen om verschillende cel fenotypes op basis van verschillen in hun voortschrijdende gedrag 3, 9-12 aparte mogelijk te maken. Dit werk kan dus nuttig zijn voor het ontwerp van apparaten voor cel-scheiding en analyse op basis van interactie tussen cellen liganden en het patroon asymmetrische receptoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door de Deshpande Centrum voor Technologische Innovatie aan MIT (RK en JMK) en de NSF LOOPBAAN award 0.952.493 tot RK door de chemische en biologische scheidingen programma. Wij danken het Instituut voor Nanotechnologie Soldier (ISN) en de Microsystems Technology Laboratory (MTL) op MIT voor het gebruik van hun faciliteiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human promyelocytic leukemia cells | ATCC | CCL-240 | HL60 cells |
| Gold-coated glass slides | EMF | TA134 | Gold slides |
| (1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | PEG |
| Recombinant human P-selectin | R&D Systems | ADP3-050 | P-selectin |
| Bovine serum albumin | Rockland Immunochemicals | BSA-50 | BSA |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Mediatech, Inc. | 21-030 | DPBS |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 316989 |
References
- Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors. Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).
- Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns. Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).
- Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1. Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).
- Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H.
- James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing. Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).
- Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers. Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).
- Matlab Particle Tracking. , Avaliable from: http://physics.georgetown.edu/matlab/ Forthcoming.
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 Forthcoming.
- Greenberg, A. W., Hammer, D. A. Cell separation mediated by differential rolling adhesion. Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).
- Higuchi, A., Tsukamoto, Y. Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).
- Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. Patterned surfaces segregate compliant microcapsules. Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).
