Summary
אנו מתארים פרוטוקול להתבונן ולנתח מסלולי מתגלגל תאים על מצעים בדוגמת אסימטרית הקולטן. את הנתונים המתקבלים שימושיים ההנדסה של הקולטן בדוגמת מצעים להפרדה-תווית חינם התא ניתוח.
Abstract
תזוזה רוחבית של תאים אורתוגונליים כדי להזרים זרם על ידי גלגול על דפוסי קולטן אסימטרית מהווה הזדמנות לפיתוח של מכשירים חדשים ההפרדה תווית חינם ניתוח של תאים 1. מכשירים כאלה עשויים להשתמש תזוזה לרוחב הפרדה רצוף זרימה, או דפוסי קולטן כי לווסת הידבקות להבחין בין פנוטיפים תאים שונים או רמות של ביטוי הקולטן. הבנת טבעה של מסלולי מתגלגל על קולטן תא בדוגמת מצעים הכרחי ההנדסה של מצעים ועיצוב של מכשירים כאלה.
הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול לחקר מסלולי התא מתגלגל על דפוסי קולטן אסימטרית התומכים הידבקות התא מתגלגל 2. מוגדרים היטב, מיקרומטר בקנה מידה דפוסי P-selectin רצפטורים היו מפוברקות באמצעות הדפסה microcontact על מצופה זהב שקופיות שולבו בחדר זרימה. HL60 תאים המבטאים את ליגנד PSGL-1 3 היו זרמו על פני השדה של קווים בדוגמת ו דמיינו על הפוך מיקרוסקופ שדה בהיר. התאים התגלגל מסומנים בשולי נוטה דפוסים, וכתוצאה מכך סטיה לרוחב 1. כל תא התגלגל בדרך כלל במרחק מסוים לאורך שולי התבנית (כהגדרתו אורך מעקב קצה), מנותקת מן הקצה, והעלה שוב לדפוס במורד הזרם. למרות ניתוק זה מקשה לעקוב אחר מסלול שלם של תא מהכניסה ליציאה בחדר זרימה, חלקיק מעקב התוכנה שימשה לנתח התשואה מסלולי גלגול של התאים בתקופה שבה הם נעים על קולטן אחד בדוגמת קו. מסלולי נבדקו ואז לקבל הפצות של גלגול מהירויות התא אורכי קצה מעקב עבור כל תא של דפוסים שונים.
פרוטוקול זה שימושי לכימות מסלולים תא מתגלגל על דפוסי הקולטן הקשור אלה פרמטרים הנדסיים כגון זווית דפוס מתח גזירה. נתונים אלה יהיה שימושי עבור העיצוב של התקנים microfluidic להפרדת-תווית חינם התא ניתוח.
Protocol
1. HL60 תא מתגלגל
1.1. המצאה של Patterned מצעים.
- באמצעות הדפסה microcontact (μCP) 4-7 לבצע לסירוגין עצמית התאספו monolayers (Sams) של מולקולות PEG על מצופה זהב שקופיות הזכוכית: לפברק הדפסה microcontact polydimethylsiloxane (PDMS) חותמות אשר הגדיר את דפוסי קולטן עם זווית הנטייה של α = 10 ° על ידי תהליך SU 8 דפוס. נקו את משטח זהב עם פתרון פיראניה (03:01 תערובת של חומצה גופרתית על חמצן ומימן 30%) למשך 20 דקות ולאחר מכן לשטוף את המשטח עם מים די שופע ב 24.5 מעלות לפני השימוש. דיו חותמת PDMS עם פתרון PEG 5mm באתנול. יבש חותמת באוויר במשך 20 דקות. בעדינות לשים את החותמת על פני השטח זהב עבור 40 שניות ולוודא שיש מגע טוב בין משטח זהב חותמת. אין לחץ עודף נדרשת. יש לשטוף את המשטח עם אתנול לייבש אותו תחת זרם של N 2.
- דגירה המצע בתוך פתרון P-selectin (15 מיקרוגרם / מ"ל ב DPBS) באמצעות תא זלוף (מדעי מיקרוסקופית אלקטרונים) במשך 3 שעות ב 24.5 ° C לדפוס אזורים שנותרו עם selectin-P. יש לשטוף את המשטח עם DPBS שופע.
- למילוי השטח עם ארגון ה-BSA (1 מ"ג / מ"ל ב DPBS) עבור h 1 לחסום הלא ספציפית אינטראקציות. יש לשטוף את המשטח עם DPBS שופע.
1.2. תא רולינג ניסויים בחדר זרימה.
- תזרים השעיה של HL60 תאים (~ 10 5 תאים / מ"ל) על משטחים בדוגמת בתא תזרים מלבני (Glycotech, Inc; רוחב w = 1.0 ס"מ, אורך = 6 ס"מ, גובה h = 0.0127 ס"מ) על 24.5 ° C. השתמש משאבת מזרק (Precision Instruments העולם, SP230IW) כדי לייצר קצב הזרימה של μL 75 / דקה, עם הלחץ גזירה המקביל סביב 0.5 dyn / 2 ס"מ (~ 0.05 אבא). חישוב מתח גזירה τ באמצעות מטוס תזרים Poiseuille המשוואה τ = 6μQ/wh 2, שם μ הוא צמיגות kinematic (0.001002 אבא ים), Q הוא קצב הזרימה volumetric, W הוא רוחב של תא הזרימה, h הוא גובה תא זרימה.
- שימוש במיקרוסקופ הפוכה (ניקון TE2000-U) עם מצלמה רכוב (אנדור iXon 885) כדי להקליט HL60 תאים המתגלגל אינטראקציות עם P-selectin מצעים דבק באמצעות 4 × אובייקטיבי, בדרך כלל בשיעור של 1 מסגרת לשנייה עבור משכי זמן של 300 s. בצעו שלושה ניסויים עצמאיים, עבור כל גודל הלחץ גזירה ונטייה זווית דפוס. מוצגים נתונים כמו סטייה ממוצעת ורמת הערכים הממוצע המתקבל כל ניסוי.
- ניתוח נתונים.
נתח את התמונה sequences על ידי תוכנית אישית (Mathworks, Inc) Matlab כי נוצלו חלקיק מעקב 8 freeware ליצור מסלולים בשולי קו בדוגמת. שירים להאריך עד סוף הלהקה P-selectin נבחרו מצויד בשני מגזרים קו ישר - אחד מיושר עם הזרם, השני מיושר עם קצה דפוס. שני אלה משמשים מגזרים אז כדי לחשב את אורך מעקב קצה, מהירות גלגול על הקצה, וגלגול מהירות על האזור רגיל.
2. נציג תוצאות:
איור (א) מראה אחד של תמונות מיקרוסקופ המרה וידאו של HL60 אינטראקציות מתגלגל עם P-selectin מצעים דבק באמצעות אובייקטיבי 4 ×. אזורים בהירים וכהים מתאימות קולטן P-selectin ואזורים PEG, בהתאמה. איור (ב) מציג את המסלולים מתקבל באמצעות תוכנית אישית Matlab. זווית הנטייה קצה היה 10 ° ואת הלחץ גזירה היה 0.5 dyn / 2 ס"מ. מעקב קצה אורך, אני הדואר, עקירה, d, ואת מהירויות מתגלגל על קצה ובתוך להקות, V ו-V e p, בהתאמה, מתוארים באיור (C-1). איור (C-2) מראה את הפצה (מספר תאים מוקלט) אורך מעקב קצה. ריבועי להראות את הערך הממוצע של l דואר ואת מהירות מתגלגל על קצה (V ה) ובתוך להקות (V p) בזווית הנטייה α = 10 ° ואת גודל נוזל מתח גזירה סביב 0.5 dyn / 2 ס"מ. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן אחת, כאשר n = 3 ניסויים לשכפל (3 משטחים לשכפל) עבור כל תנאי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תיארנו פרוטוקול לבחון מסלולים מתגלגל על קולטן תא בדוגמת משטחים סימטריים מפוברק באמצעות הדפסה microcontact 2. התמונות מיקרוסקופ אופטי של פני השטח בדוגמת מראה בניגוד ברור בין PEG ו-P-selectin אזורים ניתן להשתמש כדי לאשר הטבעה מוצלחת. שארפ, ישרות ניתן לראות כאשר ביול מבוצע היטב. קשה הקשה של הבול עלול לגרום לעיוות חותמת אשר מגביל את הדיוק של דפוסים. קצוות גלית ניתן לקבל כאשר ריכוז דיו גבוה מדי או זמן ביול ארוכה מדי. קשר רע בין הבול לבין המשטח מוביל לא אחידה דפוסי PEG כאשר בגודל של בול קטן מדי (<0.5 ס"מ 2). Non-טריים פתרון הדיו עלול לגרום לתאים מתגלגל על האזורים PEG בדוגמת בגלל היכולת ירד ל passivate P-selectin. זווית הנטייה בפועל ניתן לחשב מתמונות של הדפוס ואת מסלולי חופשי זורם תאים שאינם אינטראקציה עם המשטחים. הניסוי המתואר כאן התשואות מידע על תא יחיד מתגלגל אירועים לאורך הקצוות דפוס, אולם קשה לעקוב באופן אוטומטי אחר תאים לנתק על דפוס אחד לצרף מחדש על דפוס אחר. שינוי המרווח דפוס, למשל, עשוי לאפשר מעקב של תא בודד נתקל קצוות מרובים. יכולת זו עשויה לאפשר רזולוציה גבוהה יותר להבחנה בין תאים בעלי מאפיינים שונים המתגלגל ברמת תא בודד. כמו התנהגות התא מתגלגל תלוי ligands על התא, אנו משערים כי ניסויים כאלה עשוי לאפשר עיצוב של דפוסי המתאים להפריד פנוטיפים תאים שונים המבוססים על ההבדלים בהתנהגות שלהם מתגלגל 3, 9-12. עבודה זו יכולה ובכך להיות שימושי עבור העיצוב של המכשירים להפרדת תאים וניתוח מבוסס על אינטראקציה בין ligands התא קולטנים בדוגמת סימטרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
פרויקט זה מומן על ידי מרכז Deshpande עבור חדשנות טכנולוגית ב-MIT (ר.ק. ו JMK) ואת אות הקריירה NSF 0952493 עד ר.ק. דרך כימי וביולוגי תוכנית הפרדות. אנו מודים המכון ננוטכנולוגיות חייל (ISN) לבין טכנולוגיה Microsystems מעבדה (MTL) ב-MIT עבור שימוש במתקנים שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human promyelocytic leukemia cells | ATCC | CCL-240 | HL60 cells |
| Gold-coated glass slides | EMF | TA134 | Gold slides |
| (1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | PEG |
| Recombinant human P-selectin | R&D Systems | ADP3-050 | P-selectin |
| Bovine serum albumin | Rockland Immunochemicals | BSA-50 | BSA |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Mediatech, Inc. | 21-030 | DPBS |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 316989 |
References
- Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors. Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).
- Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns. Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).
- Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1. Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).
- Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H.
- James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing. Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).
- Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers. Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).
- Matlab Particle Tracking. , Avaliable from: http://physics.georgetown.edu/matlab/ Forthcoming.
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 Forthcoming.
- Greenberg, A. W., Hammer, D. A. Cell separation mediated by differential rolling adhesion. Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).
- Higuchi, A., Tsukamoto, Y. Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).
- Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. Patterned surfaces segregate compliant microcapsules. Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).
