Summary
Мы опишем протокол наблюдать и анализировать подвижного траекторий на асимметричные рецепторов узором субстратов. Полученные данные являются полезными для инженерно рецептора узором субстраты для этикетки без разделения клетки и анализа.
Abstract
Боковое смещение клеток ортогональной водотока путем прокатки на асимметричных моделей рецептор представляет возможность для разработки новых устройств для этикеток без разделения и анализа клеток 1. Такие устройства могут использовать боковое смещение для непрерывного потока разделения, или рецептор модели, которые модулируют адгезии различать различные фенотипы клеток или уровни экспрессии рецептора. Понимание природы клеточных подвижного траекторий на рецептор узором субстратов необходимо для инженерных подложек и дизайн таких устройств.
Здесь мы демонстрируем протокол для изучения ячейки подвижного траекторий на асимметричные модели рецепторов, которые поддерживают ячейки прокатки сцепление 2. Четко определенные, мкм масштаба модели P-селектина рецепторы были изготовлены с использованием микроконтактной печати на золотым покрытием слайды, которые были включены в проточную камеру. HL60 клеток, экспрессирующих PSGL-1 лиганд 3 были текла по области узорной линии и отображаются на ярком перевернутый микроскоп поле. Клетки проката и отслеживаются по наклонным краям узорами, в результате чего боковое отклонение 1. Каждая клетка обычно проката на определенное расстояние вдоль края шаблона (определяется как длина отслеживания край), отделен от края, и подключить к течению узор. Хотя этот отряд делает ее трудно отследить всей траектории клетку от входа, чтобы выйти в проточную камеру, частица слежения программное обеспечение было использовано для анализа и выход подвижного траектории клеток в течение времени, когда они двигались по одним рецептором узором линии. Траекторий затем были рассмотрены с целью получения распределений клеточных подвижного скоростей и края отслеживания длины для каждой ячейки для различных моделей.
Этот протокол используется для количественного ячейки подвижного траекторий на рецептор модели и связанные этим параметрам инженерных таких как угловая форма и напряжение сдвига. Такие данные будут полезны для проектирования микрожидкостных устройств для этикеток без разделения клетки и анализа.
Protocol
1. HL60 ячейки подвижного
1.1. Изготовление рисунком поверхности.
- Использование микроконтактной печати (μCP) 4-7, чтобы сделать переменного самоорганизующихся монослоев (ЗРК) ПЭГ молекул на золотым покрытием слайды стекла: Изготовление микроконтактной печати полидиметилсилоксан (PDMS) марок, что определенный рецептор модели с углом наклона α = 10 °, SU-8 процесса формования. Очистите поверхности золота с пираньи решение (3:1 смесь серной кислоты до 30% пероксида водорода) в течение 20 минут и затем ополосните поверхность с обильным воды DI в 24,5 ° C до использования. Чернила штамп PDMS с 5 мМ раствор ПЭГ в этаноле. Сухой штамп на воздухе в течение 20 минут. Аккуратно положил печать на поверхности золота в течение 40 секунд и убедитесь, что есть хороший контакт между поверхностью золота и печатью. Нет избыточного давления не требуется. Промыть поверхность с этанолом и высушить под струей N 2.
- Инкубируйте субстрата в Р-селектина решение (15 мкг / мл в DPBS) с помощью перфузионной камере (Электронная микроскопия наук) в течение 3 часов при 24,5 ° C, чтобы скопировать оставшиеся районы с P-селектина. Промыть поверхность с обильным DPBS.
- Засыпка поверхности с BSA (1 мг / мл в DPBS) в течение 1 ч для блокирования неспецифических взаимодействий. Промыть поверхность с обильным DPBS.
1.2. Сотовые Роллинг Эксперименты в потоке палаты.
- Поток приостановлении HL60 клетки (~ 10 5 клеток / мл) по сравнению с узорной поверхности в прямоугольной камере потока (Glycotech, Inc, ширина W = 1,0 см, длина = 6 см, высота Н = 0,0127 см) при 24,5 ° C. Используйте шприцевой насос (инструменты Всемирного Precision, SP230IW) для генерации скорости потока 75 мкл / мин, с соответствующими напряжение сдвига около 0,5 дин / см 2 (~ 0,05 Па). Рассчитать напряжение сдвига τ с помощью плоского течения Пуазейля уравнение τ = 6μQ/wh 2, где μ-кинематическая вязкость (0,001002 Па с), Q является объемная скорость потока, ш ширина потока камеры и ч является высота проточную камеру.
- Использование инвертированного микроскопа (Nikon TE2000-U) с смонтирована камера (Андор IXON 885) для записи HL60 клетки прокатке взаимодействие с клеем P-селектина подложках с использованием 4 × цель, как правило, со скоростью 1 кадр в секунду при длительности 300 s. Выполните три независимых экспериментов, для каждого сдвига величины напряжения и угол наклона картины. Представление данных, как среднее значение и стандартное отклонение средней величины, полученные от каждого эксперимента.
- Анализ данных.
Анализ последовательности изображений на индивидуальные Matlab (MathWorks, Inc) программы, которые использовали частицы отслеживания бесплатная 8 генерировать дорожки вдоль узорными краями линии. Треки продлении до конца P-селектина нитью, будут выделены и оборудованные двумя отрезками прямых линий - один в соответствие с потоком, другие приведены в соответствие с картины края. Эти два сегмента в дальнейшем используются для вычисления длины края слежения, скорость качения на краю, и скорость качения на равнине регионе.
2. Представитель Результаты:
На рисунке (А) показывает один из микроскопа изображения преобразованы из видео HL60 прокатке взаимодействие с клеем P-селектина подложках с использованием 4 × цели. Светлые и темные области соответствуют Р-селектина рецепторов и PEG регионов, соответственно. Рис (B) показывает треки получены с помощью пользовательской программы Matlab. Угол наклона края составляла 10 ° и напряжение сдвига составляла 0,5 дин / см 2. Длина ребра слежения, л е, перемещение, д, и скорости прокатки на краю и внутри групп, V е и V р, соответственно, описаны на рисунке (С-1). Рис (С-2) показывает, распределения (число зарегистрированных клеток) с длиной ребра слежения. На врезках среднее значение л е и скорость качения на краю (V е) и внутри полосы (V р) на угол наклона α = 10 ° и сдвига жидкости величины напряжения около 0,5 дин / см 2. Планки погрешностей представляют одно стандартное отклонение, где п = 3 повторить эксперименты (3 повторить поверхностей) для каждого условия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали протокол для изучения ячейки подвижного траекторий на асимметричные рецепторов узором поверхности изготовлены с использованием микроконтактной печати 2. Оптических изображений микроскопа узорчатой поверхности показывает четкий контраст между ПЭГ и Р-селектина области могут быть использованы для подтверждения того, штамповка успешно. Острые, прямые края могут наблюдаться при штамповке выполняется хорошо. Жесткий нажатием штамп может привести к деформации штамп, который ограничивает точность моделей. Волнистые края могут быть получены, когда чернила концентрация слишком высока или штампа времени слишком длинный. Плохой контакт между печатью и поверхности приводит к неравномерному модели PEG, когда размер штампа слишком мал (<0,5 см 2). Номера для свежей краски решение может привести к клеткам прокатки на ПЭГ-узорной регионах из-за снижение способности к пассивации P-селектина. Фактический угол наклона могут быть рассчитаны из образов картины и траектории сыпучих клетки, которые не взаимодействуют с поверхностями. Эксперимент, описанный здесь, дает информацию о отдельная клетка подвижного событий вдоль краев картины, однако, трудно для автоматического отслеживания клетки, которые отсоединения на один шаблон и повторно прикрепить на другую модель. Изменение сеткой скважин, например, может включить отслеживание одной клетки сталкиваются кратных ребер. Эта способность может позволить более высокое разрешение для различения клеток с разными ходовые характеристики на одном уровне клетки. Как клетка подвижного поведение зависит от лигандов на клетки, мы предполагаем, что такие эксперименты могут позволить разработку соответствующих шаблонов для отдельных различные фенотипы ячейки на основе различия в их поведении подвижной 3, 9-12. Эта работа может таким образом быть полезными для проектирования устройств для разделения клетки и анализ на основе взаимодействия между клеточными лигандами и узорные асимметричной рецепторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Этот проект был поддержан Deshpande Центр технологических инноваций в Массачусетском технологическом институте (РК и JMK) и премии NSF КАРЬЕРА 0952493 в РК через химической и биологической программы Цветоделение. Мы благодарим Институт солдата нанотехнологий (ISN) и Microsystems техническая лаборатория (МТЛ) в Массачусетском технологическом институте за использование их средств.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human promyelocytic leukemia cells | ATCC | CCL-240 | HL60 cells |
| Gold-coated glass slides | EMF | TA134 | Gold slides |
| (1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | PEG |
| Recombinant human P-selectin | R&D Systems | ADP3-050 | P-selectin |
| Bovine serum albumin | Rockland Immunochemicals | BSA-50 | BSA |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Mediatech, Inc. | 21-030 | DPBS |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 316989 |
References
- Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors. Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).
- Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns. Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).
- Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1. Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).
- Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H.
- James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing. Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).
- Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers. Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).
- Matlab Particle Tracking. , Avaliable from: http://physics.georgetown.edu/matlab/ Forthcoming.
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 Forthcoming.
- Greenberg, A. W., Hammer, D. A. Cell separation mediated by differential rolling adhesion. Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).
- Higuchi, A., Tsukamoto, Y. Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).
- Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. Patterned surfaces segregate compliant microcapsules. Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).
