Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Asimetrik Reseptör Desenler Hücre Rolling Yörüngeler incelenmesi

Published: February 13, 2011 doi: 10.3791/2640
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2
1Department of Materials Science and Engineering, MIT - Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Mechanical Engineering, MIT - Massachusetts Institute of Technology, 3HST Center for Biomedical Engineering and Harvard Stem Cell Institute, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School

Summary

Biz asimetrik reseptör-desenli yüzeyler üzerinde hücre haddeleme yörüngelerini gözlemlemek ve analiz etmek için bir protokol açıklar. Ortaya çıkan veriler etiket ücretsiz cep ayırma ve analiz için reseptör-desenli yüzeylerin mühendisliği için yararlıdır.

Abstract

Yanal deplasman asimetrik reseptör desenleri üzerinde yuvarlanan bir akış akışa dik hücreleri, hücreler 1 etiket ayırma ve analiz için yeni cihazlar geliştirilmesi için bir fırsat sunar . Bu tür cihazlar sürekli akış ayrılması, ya da farklı hücre fenotipleri veya reseptör ekspresyonu düzeyleri birbirinden ayırt etmek yapışma modüle reseptör desen yanal deplasman kullanabilirsiniz. Hücre reseptör-desenli yüzeyler üzerinde yuvarlanma yörüngeleri doğasını anlamak yüzeyleri ve bu tür cihazların tasarım mühendisliği için gerekli.

Burada, biz, hücre haddeleme yapışma 2 destekleyen asimetrik reseptör desen hücre haddeleme yörüngeleri eğitim için bir protokol göstermektedir . İyi tanımlanmış, P-selektin reseptörleri mikron çaplı bir desen, bir akış odasında dahil edildi altın kaplı slaytlar üzerinde baskı microcontact kullanılarak imal edildi. PSGL-1 ligand 3 ifade HL60 hücreleri desenli çizgiler bir alan boyunca aktı ve ters bir aydınlık alan mikroskobu görüntülendi. Hücreler lateral çökme 1 desen eğimli kenarları boyunca rulo ve paletli. Her hücre, tipik olarak belirli bir mesafe (kenar izleme uzunluğu olarak tanımlanır) desen kenarlarında haddelenmiş kenarına kopuk ve bir alt-desen yatışma. Bu dekolmanı zor akışını odasına çıkmak için girişten itibaren bir hücrenin tüm yörünge takip hale getirse de, parçacık izleme yazılımı, tek bir reseptör üzerinde hareket olduğu zaman yuvarlanma sırasında hücrelerin yörüngeleri analiz ve verim desenli hat. Yörüngeleri, daha sonra hücre haddeleme hızları ve her hücre için farklı desen izleme kenar uzunlukları dağılımları elde etmek için incelendi.

Bu protokol, hücre reseptör desen haddeleme yörüngeleri ölçülmekte ve desen açısı ve kayma gerilmesi gibi bu mühendislik parametrelerini ilgili yararlıdır. Bu tür veriler, etiket hücre ayırma ve analiz için mikroakışkan cihazların tasarımı için faydalı olacaktır.

Protocol

1. Haddeleme HL60 hücre

1.1. Desenli Yüzeyler imalatı.

  1. Altın kaplamalı cam slaytlar PEG moleküllerinin kendi kendini monte mono tabakaları (SAMs) alternatif yapmak microcontact baskı (μCP) 4-7 kullanma: α = 10, eğim açısı ile reseptör desenleri tanımlanan microcontact baskı polidimetilsiloksan (PDMS) pulları Üretiyor SU-8 kalıplama işlemi °. 20 dakika boyunca altın piranha çözüm (sülfürik asit 03:01 karışımı% 30 hidrojen peroksit) ile yüzeyi temizleyin ve sonra, bol DI su ile 24.5 ° C önceden az yüzey durulayın. Etanol 5mM PEG solüsyonu ile Mürekkep PDMS damgası. 20 dakika boyunca hava damga kurulayın. 40 saniye süreyle yavaşça altın yüzeyinde pul koymak ve altın yüzey arasında iyi bir iletişim ve damgası olduğundan emin olun. Aşırı basınç gerek yoktur. Etanol ile yüzey N 2 akışı altında durulayın ve kurulayın.
  2. Yüzey 24,5 az 3 saat boyunca perfüzyon odası (Elektron Mikroskobu Bilimleri) kullanarak ° C desen P-selektin ile diğer alanlar. P-selektin çözüm (15 mg / DPBS mL) içinde inkübe Yüzey bol DPBS ile durulayın.
  3. Dolgu BSA (DPBS 1 mg / ml) ile yüzey 1 saat non-spesifik etkileşimleri engellemek için. Yüzey bol DPBS ile durulayın.

1.2. Hücre Akış Odası Rolling Deneyler.

  1. HL60 hücreleri (~ 10 5 hücre / ml) (genişliği w = 1,0 cm, uzunluğu = 6 cm; Glycotech, Inc yüksekliği h = 0,0127 cm) dikdörtgen bir akış odasında desenli yüzeyler üzerinde bir süspansiyon Akış 24.5 ° C 75 mcL / dak akış hızı üretmek için yaklaşık 0.5 dyn / cm 2 (~ 0.05 Pa) karşılık gelen kayma gerilmesi, bir şırınga pompası (Dünya Hassas Aletler, SP230IW) kullanın . Kayma gerilmesi τ uçağın Poiseuille hacimsel debisi Q μ kinematik viskozitesi (0.001002 Pa ler) τ = 6μQ/wh 2, akış denklemi kullanarak hesaplayın, w akışını odasının genişliği ve h yüksekliği akış odasına.
  2. 300 süreleri için genellikle saniyede 1 kare hızında, 4 kullanarak yapışkan P-selektin yüzeyler ile etkileşim haddeleme HL60 hücreleri kaydetmek için monte edilmiş bir kamera (Andor IXON 885) × amacı ile bir inverted mikroskop (Nikon TE2000-U) kullanın s Her kayma gerilmesi büyüklüğü ve desen eğim açısı için üç bağımsız deneyler, gerçekleştirin. Her deneyden elde edilen ortalama değerler ortalama ve standart sapma gibi mevcut veri.
  3. Veri Analizi.
    Görüntü dizileri bir parçacık desenli hat kenarlarında parçaları üretmek için ücretsiz 8 izleme kullanılan özelleştirilmiş bir Matlab (Mathworks, Inc.) Programı tarafından analiz edin. P-selektin bandının sonuna kadar uzanan parçalar seçilir ve iki düz çizgi parçaları ile donatılmış akışı ile uyumlu bir desen kenarı ile uyumlu diğer. Bu iki parça daha sonra kenarına hız haddeleme, ve düz bir bölgeye hız haddeleme, kenar izleme uzunluğunu hesaplamak için kullanılır.

2. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1
Şekil (A) 4 × amacı kullanarak yapışkan P-selektin yüzeylerde HL60 haddeleme etkileşimleri video dönüştürülür mikroskop görüntülerini bir gösterir. Parlak ve koyu bölgeler sırasıyla, P-selektin reseptör ve PEG bölgelere karşılık gelir. Şekil (B) özelleştirilmiş bir Matlab programı kullanılarak elde parçalarını gösterir. Kenar eğim açısı 10 ° ve kayma gerilmesi 0.5 dyn / cm 2 idi. (C-2), kenar izleme uzunluğu, l e, deplasman, d ve kenarında ve haddeleme hızları sırasıyla bantlar, V e ve V p, içinde, (C-1) Şekil olarak açıklanmıştır. Şekil gösterir kenar izleme uzunluğu dağılımı (kaydedilen hücrelerinin sayısı). Insets l e ortalama değer ve kenarında haddeleme hızı (V e) ve (V p), eğim açısı, bantları içinde α = 10 ° ve sıvı shear stresin büyüklüğü 0.5 dyn / cm 2 civarında . Hata çubukları, bir standart sapma, n = 3, her durum için çoğaltmak denemeleri (3 çoğaltmak yüzeyler) temsil

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz microcontact baskı 2 kullanılarak üretilen asimetrik reseptör desenli yüzeyler hücre haddeleme yörüngeleri incelemek için bir protokol tanımlanmıştır. PEG ve P-selektin alanlar arasında belirgin kontrast gösteren desenli yüzey optik mikroskop görüntüleri damgalama başarılı olup olmadığını teyit etmek için kullanılabilir. Keskin, düz kenarlar damgalama iyi yapıldığında görülebilir. Hard damga basarak desen hassas sınırlar damga deformasyona neden olabilir. Dalgalı kenarları mürekkep konsantrasyonu çok yüksek veya damgalama süresi çok uzun zaman elde edilebilir. Damga boyutu çok küçük (<0.5 cm 2) zaman damgası ve yüzey arasındaki Kötü temas üniform olmayan PEG desen yol açar. Sigara taze mürekkep bir çözüm, çünkü P-selektin etkisizleştirmek için azalmış kabiliyet PEG desenli bölgeleri üzerinde yuvarlanan hücrelerinde neden olabilir. Gerçek eğim açısı, yüzeyler ile etkileşim değil, serbest akan hücrelerinin desen ve yörüngeleri görüntüleri hesaplanabilir. Deney desen kenarlarında yuvarlanma olaylar bireysel hücre hakkında bilgi verim açıklanan, ancak bunu otomatik olarak bir desen ayırmak ve başka bir desen üzerinde yeniden takmak hücreleri izlemek için zordur. Desen aralıkları değiştirme, örneğin, tek bir hücrenin birden fazla kenarları karşılaşmadan izlemeyi etkinleştirmek olabilir. Bu yetenek, tek hücre düzeyinde farklı haddeleme özelliklere sahip hücreler arasındaki ayrım daha yüksek çözünürlük sağlar. Haddeleme davranış hücre hücre ligandlar bağlı olarak, bu tür deneyler uygun desen tasarımı, 9-12 3, haddeleme davranış farklılıkları dayalı farklı hücre fenotipleri ayrı etkinleştirebilirsiniz hipotez . Bu çalışma, bu nedenle cihazların tasarımı için hücre ligandlar ve desenli asimetrik reseptörleri arasındaki etkileşim dayalı hücre ayırma ve analizi için yararlı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu proje, MIT'de Deshpande Teknolojik Yenilik Merkezi (RK ve JMK) ve Kimyasal ve Biyolojik Ayrımları programı ile RK NSF KARİYER ödül 0.952.493 tarafından desteklenmiştir. Biz Asker Nanoteknolojiler (ISN) ve tesislerin kullanımı için MIT'de Microsystems Teknoloji Laboratuvarı (MTL) Institute for teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human promyelocytic leukemia cells ATCC CCL-240 HL60 cells
Gold-coated glass slides EMF TA134 Gold slides
(1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 674508 PEG
Recombinant human P-selectin R&D Systems ADP3-050 P-selectin
Bovine serum albumin Rockland Immunochemicals BSA-50 BSA
Dulbecco’s phosphate buffered saline Mediatech, Inc. 21-030 DPBS
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 339741
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich 316989

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors. Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).
  2. Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns. Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).
  3. Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1. Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).
  4. Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H. Printing patterns of proteins. Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).
  5. James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing. Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).
  6. Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).
  7. Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers. Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).
  8. Matlab Particle Tracking. , Avaliable from: http://physics.georgetown.edu/matlab/ Forthcoming.
  9. Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 Forthcoming.
  10. Greenberg, A. W., Hammer, D. A. Cell separation mediated by differential rolling adhesion. Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).
  11. Higuchi, A., Tsukamoto, Y. Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).
  12. Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. Patterned surfaces segregate compliant microcapsules. Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).

Tags

Biyomühendislik Sayı 48 hücre haddeleme microcontact baskı hücre yapışma hücre analizi hücre ayrımı P-selektin
Asimetrik Reseptör Desenler Hücre Rolling Yörüngeler incelenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, C., Bose, S., Van Vliet, K. J., … More

Lee, C., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns. J. Vis. Exp. (48), e2640, doi:10.3791/2640 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter