Summary
Nosso grupo desenvolveu um sistema de cultura biorreator que imita as tensões pulsátil fisiológica do sistema cardiovascular para regenerar implantáveis de pequeno diâmetro enxertos vasculares.
Abstract
Muito esforço tem sido dedicado a desenvolver e fazer avançar a metodologia para regenerar funcional de pequeno diâmetro arterial ignora. No ambiente fisiológico, tanto a estimulação mecânica e química são necessários para manter o bom desenvolvimento e funcionalidade de 1,2 vasos arteriais.
Sistemas de cultura biorreator desenvolvido pelo nosso grupo são projetados para suportar a regeneração navio dentro de um ambiente controlado com precisão químico-mecânico que imita a de vasos nativos. Nossa assembléia biorreator e procedimentos de manutenção são bastante simples e altamente repetitivo 3,4. Células musculares lisas (PMEs) são semeados em um ácido poliglicólico tubular (PGA) de malha que é rosqueado ao longo tubo de silicone compatível e cultivadas em biorreator, com ou sem estimulação pulsátil por até 12 semanas. Há quatro principais atributos que distinguem o nosso biorreator de alguns antecessores. 1) Ao contrário dos sistemas outra cultura que simulam apenas o bioquímico em torno dos vasos sanguíneos nativo, nosso biorreator também cria um ambiente fisiológico pulsátil, aplicando tensão radial cíclica para os vasos em cultura. 2) Várias embarcações de engenharia podem ser cultivadas simultaneamente em diferentes condições mecânicas dentro de um ambiente químico controlado. 3) O biorreator permite uma camada mono de células endoteliais (CE) para ser facilmente revestidas no lado luminal dos vasos de engenharia para implantação de modelos animais. 4) Nossas biorreator também pode vasos cultura projetada com diâmetro diferentes variou de 1 mm a 3 mm, salvando o esforço para adaptar cada biorreator individuais para caber um diâmetro específico.
Os vasos engenharia cultivadas em nosso biorreator assemelham vasos sanguíneos nativa histologicamente em algum grau. Células nas paredes dos vasos expressam marcadores madura SMC contrátil, como suave cadeia muscular miosina pesada (SMMHC) 3. Uma quantidade substancial de colágeno é depositado dentro da matriz extracelular, que é responsável pela resistência mecânica final das embarcações engenharia 5. Análise bioquímica também indica que o conteúdo de colágeno dos vasos engenharia é comparável à de artérias nativas 6. Importante, o biorreator pulsátil tem constantemente regenerado vasos que apresentam propriedades mecânicas que permitem experiências de implantação bem sucedida em modelos animais 3,7. Além disso, este biorreator pode ser modificado para permitir a avaliação em tempo real e controle de remodelação do colágeno ao longo do tempo, de forma não invasiva, utilizando um microscópio óptico não-linear (NLOM) 8. Para concluir, este biorreator deve servir como uma excelente plataforma para estudar os mecanismos fundamentais que regulam a regeneração funcional de pequeno diâmetro enxertos vasculares.
Protocol
Autoclave
Montar e autoclave a tubulação para o sistema de fluxo e componentes biorreator (biorreator si ea tampa rolha de silicone) conforme as instruções na Figura 1 e Figura 2. Alimentação por sonda tem um conector macho em uma extremidade e uma extremidade aberta do outro lado. Três segmentos de tubos curtos são inseridos através de uma tampa de silicone para a troca de gás.
1. Costura PGA Malha
- Corte PGA malha para 1,1 centímetros x ~ folha de 8 cm (dependendo do tamanho biorreator).
- Tubo de silicone Limpo (diâmetro interno de 3 mm) com água destilada (Dh20) e ar seco antes do uso.
- Use sutura Dexon 6,0 a costurar PGA mesh ao redor do tubo de silicone limpa começando com três nós cirúrgico seguido de pontos simples.
2. PGA Andaimes Tratamento de Superfícies
- Dip andaimes PGA em NaOH 1M por 1-2min e registrar o tempo de tratamento e usar o mesmo tempo para todos os andaimes PGA.
- Enxágüe PGA andaimes em banhos dH2O por 2 minutos 3 vezes.
- Pat PGA andaimes seco com Kimwipes entre cada mergulho na dH 2 banheiros O.
- Seca PGA andaimes sob a capa de cultura de tecidos para o ar seco por 15 minutos com ventilador ligado.
3. Costura braços Dacron
- Use sutura Prolene 4.0 para costurar pequenos pedaços de cuffs de Dacron (1cm) em cada extremidade da malha PGA com uma sobreposição de 2-3mm. Nota: tenha cuidado para não perfurar tubos de silicone (Figura 3).
- Use a sutura mesmo a costurar três pontos ao redor da extremidade livre de algemas Dacron. Certifique-se de deixar suturas suficiente nas extremidades livres de sutura Prolene para o passo 5.1 (Figura 3).
4. Montagem de biorreator (dia antes do início da cultura biorreator)
- Mergulhe malha costurada e tubos de silicone, instrumentos cirúrgicos, e um fio fino em um banho de etanol 70% por 20-30 minutos.
- Abrir a autoclave bolsas contendo o biorreator e submergir-lo em banho de etanol 70% por pelo menos 30 minutos antes da montagem. Certifique-se de lavar o biorreator exaustivamente com etanol. Exposição de todos os componentes biorreator para o etanol 70% é um passo além da esterilização. Esta etapa também remove endotoxinas, que não é removido por autoclavagem e é prejudicial para as células vasculares.
- Puxe tubo de silicone pelo lado de armas usando fio fino para retirá-lo completamente.
- Tome biorreator de banho de etanol (mesh manter submerso em etanol). Corrigir o andaime PGA dentro do biorreator pela fixação cuffs de Dacron sobre os lábios de vidro queimado apertando e amarrar as suturas Prolene (Figura 3).
- Conecte um lado de braços laterais biorreator para conectores através de tubos de silicone.
- Puxe outro lado da tubagem de silicone com tensão suficiente e inserir os restantes dois conectores para tubos de silicone. Segure-se em tubo de silicone firmemente ao inserir conectores!
- Reinserir biorreator em banho de etanol e lave com etanol puxando conectores para fora dos braços laterais.
- Virar biorreator mais e permitir que um molho por 10 minutos.
- Biorreator virar o lado direito para cima e deixe de molho por mais 10 minutos.
- Drene todo o etanol.
- Criou três grandes pratos de Petri (10 cm) em série e biorreator lugar no prato centro para segurar o excesso de etanol pingava das extremidades dos tubos.
- Lave biorreator e PGA malha com água de cultura de tecidos utilizando um 5ml ou 10ml pipeta. Também a água lave cultura de tecidos em tubos de silicone.
- Completamente drenar toda a água em excesso em placas de Petri de cada lado do biorreator.
- Biorreator secar durante a noite na capa com ventilador ligado e OFF UV.
- Notas adicionais: certifique-se barra de agitação estéril é em biorreator. Certifique-se de não "pairar" sobre o biorreator deste ponto em diante, para evitar a contaminação. Corta-se a abundância de tiras de parafilme e mergulhe-os em um banho de etanol 70% pequenas (placa de Petri grandes funciona bem).
5. Dia 1: Configuração biorreator
- Coloque uma placa de Petri estéreis sobre abertura de cada biorreator para proteger a PGA andaime dentro de contaminantes.
- Montar sistema de fluxo de biorreator, como indicado na figura 4 e parafilme todas as juntas de ligação.
- Limpe os conectores primeiro com algodão embebido em álcool.
- Anexar porta de injeção no braço, o terceiro não utilizada do biorreator.
- Remover tubos morsa e gravata azul off final da diluição salina definida como perto de Y-junção possível. Puxe fixação de tubo no local para garantir que não haja transferência de líquidos a esta parte do tubo
- Remover saco IV, e anexar tubulação morsa (vermelha) para até final de saco IV. Certifique-se de limpar porta de inserção com álcool limpe primeiro.
- Walrus anexar a um lado do sistema de fluxo (via tubo branco final).
- Inserir torneira de 3 vias no sistema de fluxo.
- Remover transdutor de pressão e conectar-se a torneira de três vias.
- Ligue a outra extremidade do transdutor de pressão para abertura central no saco.
- Conectaro biorreator para o sistema de fluxo através do Y-junction. Use uma seringa de 60ml para adicionar 350ml de 1 Fungizone% (Fungizone mistura de 5 ml com 495ml de PBS) para bolsa de soro.
- Aperte o saco IV para lavar o sistema de fluxo, ajustando os galos parar para permitir o fluxo de PBS. Nota: verificar dentro biorreator para garantir que não haja vazamento.
- Re-suspender 8 x10 6 células musculares lisas (cerca de um confluentes T75) em 1.25ml de médio e de sementes em cada scafffold PGA. Certifique-se de suspensão de células tem sido uniformemente pingou sobre a junção PGA malha de Dacron, bem como para o lado inferior da PGA malha.
- Limpe borda do biorreator com álcool limpe via rotação do biorreator para os lados evitar pairando.
- Silicone conjunto da tampa rolha (Figura 2)
- Peel saco de autoclave para trás com cuidado, tomando cuidado para não expor a parte inferior da tampa.
- Anexar porta de injeção ao tubo de alimentação no conector macho.
- Anexar PTFE 0,20 mM filtros a cada uma das três portas ar.
- Tenha cuidado para não expor / toque de fundo da tampa durante este processo.
- Parafilm a porta de injeção.
- Insira a tampa rolha de silicone em biorreator de vidro e certifique-se que o tubo de alimentação no interior do biorreator não toca o andaimes semeado PGA. Parafilme em torno da tampa.
- Lugar biorreator com o sistema de fluxo dentro da incubadora (de lado) e gire o biorreator a cada 5 minutos por 25-30 minutos.
- Encher a câmara de biorreator com 400ml de nossos meios de cultura 10/04, conforme descrito no (Quadro 1). Este meio de cultura é "otimizado" para as artérias suína engenharia.
6. Dia 07/06: Ligar a bomba e primeira alimentação
- Crescer os andaimes semeado estaticamente, sem qualquer pulsátil bombeamento através do tubo de silicone para 07/06 dias. Não há necessidade de mudança médio ou suplementação de vitamina C durante este tempo.
- Certifique-se que não há fugas de PBS ou dobras da tubulação do sistema de fluxo antes de ligar a bomba.
- Ligue a bomba do sistema de fluxo e certifique-se de ajustar a configuração da bomba para que a pressão lê aproximadamente 270/-30mmHg.
- Pressões registro diário em toda a cultura e manter a pressão na 270/-30mmHg. Transdutor de pressão pode ser conectado a um computador para ler e monitorar a pressão.
Alimentação primeira
- Montar a injeção porta e PTFE filtro para alimentação de tampas tanto para a mudança de médio e médio fins resíduos destituição.
- Coloque o tubo de alimentação firmemente na bomba e coloque uma extremidade à porta de alimentação do biorreator ea outra extremidade à tampa de alimentação. Certifique-se de limpar as portas de injeção com toalhetes de etanol.
- Usar um dual-direcional bomba Masterflex a bomba de fora 200ml de meio. Em seguida, use um tubo de alimentação nova bomba de 200ml de meio fresco de volta para o biorreator. Sempre começar com uma velocidade muito lenta, especialmente quando o bombeamento de volta para o meio biorreator.
- Mudança de médio e complementar 2x/semana ácido ascórbico. Para adicionar o ácido ascórbico, use uma seringa de 30ml para tirar 25ml de meio e colocá-la de lado na capa de tecido. Dissolver 25 mg de ácido ascórbico em 5ml de PBS e filtrá-la através de um filtro de 0,22 mM. Primeiro injetar o ácido ascórbico estéril no tubo de alimentação e adicionar novamente o meio de 25ml retirado anteriormente. A receita média é dada na Tabela 1.
7. Resultados representativos:
Figura 1. A tubulação e conectores para a montagem do sistema de fluxo é mostrado acima.
Figura 2. O conjunto da tampa rolha de silicone é mostrado acima.
Figura 3. Esquemas de montagem biorreator são mostrados acima. Dentro do cuffs de Dacron biorreator são fixados para os braços de vidro com os nós de sutura azul.
Figura 4. Sistema de fluxo conectado à tubulação e biorreator é mostrado acima. L/S18 tubulação será bombeada por uma bomba Masterflex e, portanto, dirigir o fluxo. O transdutor de pressão medirá a pressão antes de entrar no biorreator de fluxo superior.
Figura 5. Imagem do navio colhido de engenharia. Vasos Engineered aparecerá para ser opaco e atingir uma espessura de parede de aproximadamente 250μm após 8 semanas de cultura em condições pulsátil.
Figura 6. Hematoxilina e eosina secções transversais dos vasos de engenharia. A e B são de 8 semanas não-pulsado e pulsado vasos, respectivamente.C e D são quatro semanas de embarcações não-pulsado e pulsado, respectivamente. L indica o lado luminal dos vasos. A barra de escalas é 100μm.
Figura 7. Manchas tricrômico de Masson para colágeno (azul) para seções transversais dos vasos de engenharia. A e B são de 8 semanas, os navios não-pulsado e pulsado, respectivamente. C e D são quatro semanas de embarcações não-pulsado e pulsado, respectivamente. Note-se que o navio de 4 semanas pulsado mostra mais colágeno do que suas contrapartes não-pulsado. Setas brancas apontam para fragmentos restantes PGA nos vasos. A barra de escalas é 100μm.
Figura 8. Coloração imunoquímica de marcadores SMC em bovinos artérias de engenharia. Músculo liso α-actina, calponin-1, e de músculo liso cadeia de miosina pesada (SMMHC) são precoces, intermediárias e tardias SMC marcadores contrátil, respectivamente. Até o final de 12 semanas de cultura, as células da parede do vaso expressar SM α-actina e quantidades moderadas de Calponin-1 e SMMHC. A barra de escalas é 20Hm.
| Componente | Quantidade |
| DMEM (DME / baixa modificado) | 500 ml |
| FBS (soro fetal bovino) inativados pelo calor | 100 ml |
| HEPES 1,0 M | 5ml |
| Vitamina C (dissolvido em PBS ou DMEM) | 25 mg |
| Prolina / Glycine / Alanina 25 mg/25 mg/10 mg (dissolvido em 5ml de PBS) | 5ml |
| CuSO 4 1,5 g (dissolvido in1 ml de PBS) | 1ml |
| Penicilina G a 10.000 unidades / ml | 5ml |
| PDGF-BB (derivado de plaquetas-BB growth factor) em 10ng/ml | 5μg |
| bFGF (fator de crescimento básico de fibroblastos) em 10ng/ml | 5μg |
Tabela 1. Componentes de "40-10" médio são apresentados na tabela acima. Com a exceção de PDGF-BB e bFGF, todos os outros componentes estão a ser filtrado por um filtro de 0,2 Hm antes de usar.
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Discussion
A qualidade dos navios engenharia é em grande parte ditada pela qualidade do SMCs usado em cultura de tecidos. Os aspectos críticos do fenótipo contrátil SMC incluem morfologia, número de passagem baixa, ea capacidade de proliferar no interior do biorreator. Recomendamos que o número de passagem pode ser maior que P3, no momento da semeadura de células para o cadafalso polímero. Além disso, é crucial para confirmar que as fontes de SMC são livres de micoplasma antes do uso. Temos observado que as células contaminadas por micoplasma-levar a diminuições substanciais na proliferação celular e deposição de matriz de colágeno em cultura biorreator.
Mais de 400.000 enxertos de artéria coronária são necessários para operações de desvio a cada ano, resultando em uma alta demanda de diâmetro pequeno (<6 mm) enxertos vasculares 12. O objetivo final é engenheiro funcionais vasos de pequeno diâmetro que imitam as funções fisiológicas do tecido original. Nosso sistema de biorreator pulsátil é um meio promissor para constituir funcional enxertos arteriais que pudessem substituir e restaurar artérias doentes. Em um ambiente quimicamente e mecanicamente controlada, o biorreator nos permite engenheiro implantáveis pequeno diâmetro dos vasos que apresentam retenção de sutura forte e excelentes propriedades mecânicas. O sistema biorreator pulsátil pode ser usado para reconstruir artérias de bovinos 3, suínos 6,7, e 9 células humanas em vários tamanhos e dimensões, tornando assim este sistema generalizável e versátil. Além disso, modificamos o nosso biorreator para permitir que imagens em tempo real da matriz extracelular vascular, não-invasiva 8. A abordagem combinada de nossa biorreator, técnicas não-invasivas de imagens de microscopia, e avançado avaliações biomecânicas nos ajudará a entender e avaliar a deposição ECM e as mudanças no vascular propriedades mecânicas ao longo do tempo.
Portanto, este sistema biorreator oferece uma abordagem única para engenheiro biológico baseado em enxertos vasculares, que podem desempenhar um papel importante na regeneração de enxertos vasculares autólogos em futuras aplicações clínicas 10,11.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho é financiado pelo National Institutes of Health Grant R01 EB-008836 e R01 HL083895 (tanto para LEN). Poderíamos agradecer a Daryl Smith, o Glassblower University, para fazer o biorreatores para a nossa pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS (Fetal Bovine Serum) Heat-Inactivated | Hyclone | SH30071 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| rhFGF-basic | R&D Systems | 234-FSE | |
| rrPDGF-BB | R&D Systems | 520-BB | |
| Penicilin G | Sigma-Aldrich | PENNA | |
| Copper(II) Sulfate | Sigma-Aldrich | C8027 | |
| Gylcine | Sigma-Aldrich | C8790 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-25G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Silicone Stopper | Cole-Parmer | 06298-24 | |
| Masterflex tubes L/S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 | |
| Masterflex pump | Cole-Parmer | 7553-80 | |
| Dacron cuff | Maquet | 174406 | |
| PGA felt | Concordia | MO000877-01 | |
| 4-0 1.5 metric Surgipro II suture | Syneture | VP-557-X | |
| 6-0 0.7 metric Dexon suture | Syneture | 7538-11 | |
| 0.22μm PTFE filters | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
| Three Way Stop-cock | Edwards Lifesciences | 593WSC | |
| Pressure Transducer | Edwards Lifesciences | PX212 | |
| IV bags | Baxter Internationl Inc. | R4R2110 | |
| Saline dilution set | Arrow International | W20030 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain | F05027 |
References
- Risau, W., Flamme, I.
- Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion. Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).
- Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R.
- Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).
- Mitchell, S. L., Niklason, L. E. Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts. Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).
- Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries. Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).
- Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).
- Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valentín, A., Humphrey, J. D. Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).
- Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -c, Krause, D., Niklason, L. E. Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).
- Gong, Z. D., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs. Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).
- Poh, M. Blood vessels engineered from human cells. Lancet. 365, 2122-2124 (2005).
- American Heart Association. Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , American Heart Association. (2002).
