Summary
הקבוצה שלנו פיתחה תרבות bioreactor מערכת המחקה את מדגיש pulsatile פיזיולוגיות של מערכת הלב וכלי הדם להתחדש מושתלת בקוטר קטן שתלי כלי דם.
Abstract
מאמץ רב הוקדשה להתפתח ולהתקדם את המתודולוגיה להתחדש פונקציונלי בקוטר קטן עורקים עוקף. בסביבה פיזיולוגיים, הן גירוי מכני כימי נדרשים לשמור על פיתוח פונקציונליות נכונה של 1,2 כלי העורקים.
מערכות bioreactor תרבות שפותחה על ידי הקבוצה שלנו נועדו לתמוך התחדשות כלי בתוך סביבה הכימותרפיה מכני מבוקר דווקא מחקה כי כלי הילידים. הרכבה bioreactor שלנו ונהלים תחזוקה הם פשוטים למדי הדיר מאוד 3,4. לתאי שריר חלק (SMCs) הם זורעים על חומצה polyglycolic רשת צינורי (PGA) כי הוא מושחל על צינורות סיליקון תואם תרבותי bioreactor עם או בלי גירוי pulsatile עד 12 שבועות. ישנם ארבעה מאפיינים עיקריים המבדילים bioreactor שלנו כמה מקודמיו. 1) בניגוד למערכות אחרות, כי תרבות לדמות רק ביוכימיים המקיף של כלי דם מקומיים, bioreactor שלנו גם יוצר סביבה pulsatile פיזיולוגיים ידי יישום זן רדיאלי מחזורית לכלי בתרבות. 2) כלי מהונדסים מרובים יכול להיות מתורבת בו זמנית בתנאים מכניים שונים בסביבה כימית מבוקרת. 3) bioreactor מאפשר שכבה מונו של בתאי האנדותל (EC) להיות מצופה בקלות על הצד luminal כלי מהונדסים עבור מודלים השתלה מהחי. 4) bioreactor שלנו יכולים גם כלי תרבות מהונדסים עם גודל קוטר שונה נע בין 1 מ"מ עד 3 מ"מ, שמירת מאמץ כדי להתאים לכל bioreactor הפרט להתאים גודל קוטר מסוים.
כלי הנדסה בתרבית bioreactor שלנו להידמות כלי הדם יליד בהיסטולוגיה במידה מסוימת. התאים בדפנות כלי להביע בוגרת סמנים SMC כגון התכווצות שרירים שרשרת חלקה שרירן כבד (SMMHC) 3. כמות ניכרת של קולגן מופקד בתוך המטריצה תאיים, אשר אחראי על חוזק מכני האולטימטיבי של כלי הנדסה 5. אנליזה ביוכימית גם מציין כי תוכן קולגן של כלי הנדסה דומה לזו של העורקים יליד 6. חשוב לציין כי bioreactor pulsatile יש כלי מחדש באופן עקבי כי התערוכה תכונות מכאניות המאפשרות השתלת ניסויים מוצלחים בבעלי חיים 3,7. בנוסף, bioreactor זה יכול להיות שונה יותר, כדי לאפשר בזמן אמת הערכה ומעקב של שיפוץ קולגן לאורך זמן, הלא פולשני, באמצעות מיקרוסקופ אופטי שאינו ליניארי (NLOM) 8. לסיכום, bioreactor זה אמור לשמש פלטפורמה מצוינת ללמוד את המנגנונים הבסיסיים המווסתים את התחדשות של בקוטר קטן שתלי תפקודי כלי הדם.
Protocol
דוד לחץ
להרכיב את צינור החיטוי של מערכת הזרימה ורכיבים bioreactor (bioreactor עצמו את המכסה פקק סיליקון) הורה כמו באיור 1 ואיור 2. צינור האכלה יש מחבר זכר בצד אחד וסוף לפתוח בצד השני. שלושה קטעים קצרים צינורות מוכנסים דרך כובע סיליקון לחילופי הגזים.
1. תפירה PGA Mesh
- גזור PGA רשת אל 1.1cm x ~ גיליון 8cm (תלוי בגודל bioreactor).
- צינורות סיליקון נקי (קוטר פנימי 3mm) עם מים מזוקקים (dH20) ואוויר יבש לפני השימוש.
- השתמש 6.0 תפר Dexon לתפור PGA רשת סביב צינור סיליקון נקי מתחיל עם שלושה קשרים כירורגי ואחריו תפרים יחיד.
2. PGA פיגומים טיפול פני השטח
- טובלים PGA פיגומים ב 1M NaOH עבור 1-2min ולהקליט את זמן הטיפול ולהשתמש באותו הזמן עבור כל פיגומים PGA.
- לשטוף PGA פיגומים באמבטיות dH2O 2 דקות 3 פעמים.
- פט PGA פיגומים יבש עם מטבל Kimwipes בין כל DH 2 אמבטיות O.
- יבש PGA פיגומים מתחת למכסה המנוע בתרבית רקמה לייבוש באוויר במשך 15 דקות עם מפוח על.
3. דקרון נשק תפירה
- השתמש תפר Prolene 4.0 לתפור חתיכות קטנות של האזיקים דקרון (1cm) על צד של הרשת PGA עם חפיפה של 2-3mm. הערה: להיזהר לא לנקב בצינור סיליקון (איור 3).
- השתמש תפר אותו לתפור שלושה תפרים סביב הקצה החופשי של האזיקים דקרון. הקפד להשאיר מספיק התפרים בקצוות ללא תפר Prolene לצעד 5.1 (איור 3).
4. האסיפה של bioreactor (יום לפני תחילתה של תרבות bioreactor)
- משרים רשת תפור צינורות סיליקון, מכשירי ניתוח, ואת חוט דק באמבטיה אתנול 70% עבור 20-30 דקות.
- פתח את שקיות החיטוי המכיל את bioreactor ו להטביע אותו באמבטיה אתנול 70% לפחות 30 דקות לפני הרכבת. הקפידו לשטוף את bioreactor ביסודיות עם אתנול. חשיפה של כל הרכיבים bioreactor אתנול 70% הוא צעד נוסף עיקור. צעד זה גם מסיר רעלן פנימי, אשר לא הוסר על ידי מעוקר והיא מזיקה לתאי הדם.
- משוך צינורות סיליקון דרך הצד נשק באמצעות תיל דק למשוך את זה עד הסוף.
- קח bioreactor מתוך האמבטיה אתנול (לשמור על רשת שקוע אתנול). תקן הפיגום PGA בתוך bioreactor על ידי הידוק האזיקים דקרון על השפתיים זכוכית מתרחבים על ידי הידוק וקשירת את התפרים Prolene (איור 3).
- חבר צד אחד של נשק בצד bioreactor למחברים דרך צינורות סיליקון.
- משוך הצד השני של צינורות סיליקון עם מתח מספיק להכניס את שאר שני מחברי לתוך צינורות סיליקון. תחזיקי צינורות סיליקון בחוזקה בעת הוספת מחברים!
- הכנס מחדש bioreactor לאמבטיה לשטוף עם אתנול אתנול על ידי משיכתו בעדינות מחברים מתוך הנשק בצד.
- פליפ bioreactor מעל ולאפשר להשרות למשך 10 דקות.
- Bioreactor פליפ בצד ימין למעלה להשרות במשך 10 דקות נוספות.
- מסננים את כל אתנול.
- הגדרת שלוש מנות גדולות פטרי (10 ס"מ) בסדרה ו bioreactor מקום בצלחת מרכז להחזיק אתנול עודף נטף הקצוות של הצינורות.
- פלאש bioreactor ו PGA רשת עם מים רקמות התרבות באמצעות פיפטה 5 מ"ל או 10 מ"ל. גם רקמת סומק התרבות מים לתוך צינור סיליקון.
- ביסודיות לנקז את כל המים העודפים לתוך בצלחות פטרי משני צדי bioreactor.
- Bioreactor יבש לילה ברדס עם מפוח ולכבות UV.
- הערות נוספות: לוודא בר ומערבבים סטרילי הוא bioreactor. הקפד לא "לרחף" מעל bioreactor מרגע זה והלאה, כדי למנוע זיהום. חותכים את שפע של רצועות parafilm ולספוג אותם באמבטיה קטנה אתנול 70% (גדול צלחת פטרי עובד היטב).
5. יום 1: הגדרת bioreactor
- מניחים צלחת פטרי סטרילית על פתיחת bioreactor כל להגן על פיגום בתוך PGA של מזהמים.
- להרכיב מערכת זרימת bioreactor כמצוין באיור 4 ו parafilm כל המפרקים חיבור.
- נגבו מחברי הראשון עם מגבונים אלכוהול.
- צרף נמל זריקה בזרוע, השלישי בשימוש של bioreactor.
- הסר צינורות סוס ים ועניבה מקצה הכחול של דילול מלוחים כמפורט קרוב לצומת-Y האפשרי. משוך מהדק הצינור במקום כדי להבטיח שאין להעביר נוזל לחלק זה של הצינור
- הסר את שקית העירוי, & לצרף צינורות סוס ים (אדום) אל הקצה המרוחק של שקית העירוי. הקפד לנגב נמל הכניסה עם אלכוהול לנגב הראשון.
- צרף סוס ים בצד אחד של מערכת זרימה (דרך צינור סוף לבן).
- הכנס 3 כיווני שסתום לתוך מערכת הזרימה.
- הסר מתמר הלחץ & להתחבר שסתום משולשת.
- צרף הקצה השני של מתמר לחץ לפתיחת באמצע בתיק.
- לחברbioreactor למערכת לזרום דרך צומת ה-Y. השתמש במזרק 60ml להוסיף 350ml של 1% fungizone (5 מ"ל לערבב עם fungizone 495ml של PBS) כדי שקית העירוי.
- לסחוט שקית העירוי כדי לשטוף את המערכת זורם על ידי התאמת זין לעצור כדי לאפשר זרימה של PBS. הערה: לבדוק בתוך bioreactor כדי להבטיח שאין דליפה.
- Re-להשעות 8 x10 6 SMCs (על אחת ומחוברות T75) ב 1.25ml של בינוניים זרע על כל scafffold PGA. ודא ההשעיה התא כבר אחיד טפטף על צומת-PGA רשת דקרון, כמו גם על הצד התחתון של PGA רשת.
- נגב שפת bioreactor עם אלכוהול לנגב באמצעות סיבוב bioreactor לצדדים להימנע מרחף.
- מכסה סיליקון פקק ההרכבה (איור 2)
- פיל שקית החיטוי חזרה בזהירות, כדי לוודא שלא לחשוף את החלק התחתון של המכסה.
- צרף נמל הזרקה אל צינורית האכלה על המחבר הגברי.
- צרף PTFE 0.20 מסננים מיקרומטר אחד משלושת נמלי האוויר.
- היזהרו שלא לחשוף / לגעת בתחתית המכסה תוך כדי התהליך.
- Parafilm הנמל ההזרקה.
- הכנס את מכסה פקק סיליקון לתוך bioreactor זכוכית לוודא כי צינור האכלה בתוך bioreactor לא לגעת PGA פיגומים seeded. Parafilm מסביב למכסה.
- המקום bioreactor עם מערכת הזרימה בתוך האינקובטור (על צידו) וסובב את bioreactor כל 5 דקות במשך 25-30 דקות.
- מלאו את תא bioreactor עם 400ml התקשורת 4-10 התרבות שלנו כפי שמתואר (טבלה 1). בינוני זה תרבות "אופטימיזציה" של העורקים חזירי מהונדסים.
6. יום 6-7: הפעלת המשאבה, ועל האכלה ראשון
- לגדול הפיגומים seeded סטטי ללא pulsatile כל שאיבה דרך צינור סיליקון עבור 6-7 ימים. אין צורך בשינוי בינוני או תוספי ויטמין C במהלך תקופה זו.
- ודא שאין דליפה של PBS או מסתלסל של צינורות מערכת הזרימה לפני הפעלת המשאבה.
- הפעל את המשאבה של מערכת הזרימה ולוודא להתאים להגדרה המשאבה, כך הלחץ קורא 270/-30mmHg כ.
- הלחצים שיא יומי בכל תרבות לשמר את הלחץ על 270/-30mmHg. מתמר לחץ יכול להיות מחובר למחשב כדי לקרוא לפקח על לחץ.
ראשית האכלה
- להרכיב הזרקת הנמל & PTFE לסנן על האכלה מכסים לשינוי הן המדיום למטרות בזבוז בינוני deposal.
- מקמו את צינור ההאכלה בתוקף על המשאבה ולהכניס קצה אחד האכלה נמל bioreactor ואת הקצה השני מכסה האכלה. הקפד לנגב את יציאות הזרקה עם מגבונים אתנול.
- השתמש משאבה כפול כיוונית Masterflex לשאוב מתוך 200 מ"ל של מדיום. ואז להשתמש צינור האכלה חדש לשאוב 200 מ"ל של מדיום חדש בחזרה bioreactor. תמיד להתחיל עם מהירות איטית מאוד, במיוחד כאשר שאיבה בחזרה בינוני עד bioreactor.
- שנה בינונית אסקורבית תוספת 2x/week חומצה. כדי להוסיף חומצה אסקורבית, להשתמש מזרק 30 מ"ל להוציא 25ml של המדיום ולמקם אותו בצד בשכונה רקמות. להמיס 25 מ"ג של חומצה אסקורבית ב 5 מ"ל של PBS ולסנן אותה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. ראשית להזריק חומצה אסקורבית סטרילי לתוך צינור האכלה ולהוסיף גב בינוני 25ml הוציאו קודם לכן. המתכון בינוני ניתנת בטבלה 1.
7. נציג תוצאות:
באיור 1. צינורות ומחברים להרכבה מערכת זרימת מוצגת לעיל.
איור 2. פקק סיליקון הרכבה המכסה מוצגת לעיל.
איור 3. שרטוטים של ההרכבה bioreactor מוצגים לעיל. בתוך האזיקים דקרון bioreactor מהודקים אל זרועות זכוכית עם קשרים תפר כחול.
איור 4. מערכת זרימה מחוברים צינורות bioreactor מוצגת לעיל. L/S18 צינורות יהיה נשאבים על ידי משאבה Masterflex ובכך המניע את הזרימה. מתמר הלחץ יהיה למדוד את הלחץ לפני הכניסה bioreactor על הזרם העליון.
איור 5. תמונה של כלי הנדסה שנקטפו. כלי הנדסי ייראה אטום ולהשיג עובי דופן של כ 250μm אחרי התרבות 8 שבועות בתנאים pulsatile.
איור 6. Haematoxylin ו Eosin מוכתם חתכים של כלי הנדסה. A ו-B הם 8 שבועות לא פעמו וכלי פעמו, בהתאמה.C ו-D-4 שבוע כלי שאינו פעמו פעמו, בהתאמה. L מציין את הצד luminal הכלים. שורת קשקשים הוא 100μm.
איור 7. כתמים של Trichrome מאסון עבור קולגן (כחול) עבור חתכים של כלי הנדסה. A ו-B הם 8 שבועות כלי שאינו פעמו פעמו, בהתאמה. C ו-D-4 שבוע כלי שאינו פעמו פעמו, בהתאמה. שים לב כלי 4 שבועות פעמו מראה קולגן יותר ממקבילו שאינו פעמו. החצים הלבנים הצבע שנותרו שברי PGA ב הכלים. שורת קשקשים הוא 100μm.
איור 8. מכתים Immunochemistry של סמנים SMC בעורקים מהונדסים שור. שריר חלק α-אקטין, calponin-1, וחלק שרירים שרירן שרשרת כבדה (SMMHC) הם מוקדם, ביניים, ומאוחר סמנים כויץ SMC, בהתאמה. עד סוף שנת התרבות של 12 שבועות, התאים כלי הקיר להביע SM-α אקטין כמויות מתונות של Calponin-1 ו SMMHC. שורת קשקשים הוא 20μm.
| רכיב | כמות |
| DMEM (DME / נמוך שונה) | 500 מ"ל |
| FBS (העובר שור נסיוב) חום מומת | 100 מ"ל |
| HEPES 1.0 M | 5 מ"ל |
| ויטמין C (מומס PBS או DMEM) | 25 מ"ג |
| פרולין / גליצין / אלאנין 25 mg/25 mg/10 מ"ג (מומס 5 מ"ל של PBS) | 5 מ"ל |
| CuSO 4 1.5 מיקרוגרם (מומס in1 מ"ל PBS) | 1ml |
| פניצילין G ב 10,000 יחידות / מ"ל | 5 מ"ל |
| PDGF-BB (טסיות הנגזרות גורם הגדילה-BB) בשעה 10ng/ml | 5μg |
| bFGF (גורם בסיסי הצמיחה פיברובלסטים) בשעה 10ng/ml | 5μg |
טבלה 1. רכיבים של המדיום "4-10" מוצגים בטבלה לעיל. למעט PDGF-BB ו bFGF, כל הרכיבים האחרים הם להיות מסונן דרך מסנן 0.2μm לפני השימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
איכות כלי מהונדסים הוא חלק גדול מוכתבת על ידי איכות של SMCs שימוש בתרבית רקמה. היבטים קריטיים של פנוטיפ SMC כוללים מורפולוגיה כויץ, מספר מעבר נמוך, ואת היכולת להתרבות בתוך bioreactor. אנו ממליצים על מספר למעבר להיות לא יותר מ P3 בזמן זריעת תאים על גבי פיגום פולימרי. יתר על כן, חשוב לאשר את מקורות SMC חופשיים mycoplasma לפני השימוש. ראינו כי mycoplasma מזוהם תאים להוביל פוחתת משמעותית התפשטות הסלולר מטריצה בתצהיר קולגן בתרבות bioreactor.
יותר מ 400,000 שתלי העורקים הכליליים הם זקוקים לפעולות לעקוף בכל שנה, וכתוצאה מכך דרישה גבוהה בקוטר קטן (<6mm) של כלי הדם שתלי 12. המטרה הסופית היא מהנדס פונקציונלי קטן בקוטר כלי המחקות את הפונקציות הפיזיולוגיות של רקמות הילידים. מערכת bioreactor pulsatile שלנו היא מתכוונת מבטיח להוות שתלי עורקי פונקציונלי שיכול להחזיר ולהחליף העורקים הפגוע. בסביבה כימית מבוקרת מכנית, bioreactor מאפשר לנו מהנדס מושתלת קטן בקוטר כלי אצירת התערוכה כי תפר חזק תכונות מכניות מעולות. המערכת bioreactor pulsatile יכול לשמש כדי לשחזר את העורקים מ 3 שור, חזירי 6,7, ו 9 תאים אנושיים בגדלים ממדים שונים, ובכך זה להכליל מערכת צדדי. בנוסף, יש לנו שונה bioreactor שלנו כדי לאפשר בזמן אמת הדמיה של כלי הדם תאי מטריקס, הלא פולשני 8. גישה משולבת של bioreactor שלנו, לא פולשנית הדמיה שיטות מיקרוסקופיה, והערכות biomechanical מתקדמים יעזור לנו להבין ולהעריך בתצהיר ECM ואת השינויים תכונות מכניות של כלי הדם לאורך זמן.
לכן, זו מערכת bioreactor מספק גישה ייחודית מהנדס ביולוגי המבוסס על שתלי כלי דם, אשר עשוי לשחק תפקיד חשוב התחדשות שתלי כלי דם עצמיים ביישומים קליניים עתידיים 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו ממומנת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט EB-R01 ו R01 008,836 HL083895 (הן LEN). אנחנו יכולים להודות דריל סמית', נפח הזכוכית אוניברסיטת לביצוע bioreactors למחקר שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS (Fetal Bovine Serum) Heat-Inactivated | Hyclone | SH30071 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| rhFGF-basic | R&D Systems | 234-FSE | |
| rrPDGF-BB | R&D Systems | 520-BB | |
| Penicilin G | Sigma-Aldrich | PENNA | |
| Copper(II) Sulfate | Sigma-Aldrich | C8027 | |
| Gylcine | Sigma-Aldrich | C8790 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-25G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Silicone Stopper | Cole-Parmer | 06298-24 | |
| Masterflex tubes L/S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 | |
| Masterflex pump | Cole-Parmer | 7553-80 | |
| Dacron cuff | Maquet | 174406 | |
| PGA felt | Concordia | MO000877-01 | |
| 4-0 1.5 metric Surgipro II suture | Syneture | VP-557-X | |
| 6-0 0.7 metric Dexon suture | Syneture | 7538-11 | |
| 0.22μm PTFE filters | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
| Three Way Stop-cock | Edwards Lifesciences | 593WSC | |
| Pressure Transducer | Edwards Lifesciences | PX212 | |
| IV bags | Baxter Internationl Inc. | R4R2110 | |
| Saline dilution set | Arrow International | W20030 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain | F05027 |
References
- Risau, W., Flamme, I.
- Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion. Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).
- Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R.
- Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).
- Mitchell, S. L., Niklason, L. E. Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts. Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).
- Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries. Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).
- Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).
- Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valentín, A., Humphrey, J. D. Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).
- Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -c, Krause, D., Niklason, L. E. Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).
- Gong, Z. D., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs. Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).
- Poh, M. Blood vessels engineered from human cells. Lancet. 365, 2122-2124 (2005).
- American Heart Association. Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , American Heart Association. (2002).
