Summary
Unsere Gruppe hat einen Bioreaktor Kultur-System, das die physiologische pulsatile Belastungen des Herz-Kreislauf-System, um implantierbare kleinem Durchmesser Gefäßprothesen regenerieren imitiert entwickelt.
Abstract
Viel Aufwand wurde dabei auf die Entwicklung und Fortschritt der Methodik zu regenerieren funktionale kleinem Durchmesser arterielle Bypässe. In der physiologischen Umgebung, sind sowohl mechanische als auch chemische Stimulation erforderlich, um die richtige Entwicklung und Funktionalität der arteriellen Gefäße 1,2 zu halten.
Bioreaktor Kultur-Systeme von unserer Gruppe entwickelt wurden entwickelt, um Schiff Regeneration innerhalb einer genau kontrollierten chemo-mechanischen Umgebung nachahmen, die von einheimischen Schiffen zu unterstützen. Unsere Bioreaktor Montage-und Wartungsarbeiten sind recht einfach und hoch reproduzierbare 3,4. Glatte Muskelzellen (SMC) sind auf einem röhrenförmigen Polyglykolsäure (PGA) Netz, das über kompatible Silikonschlauch threaded ist und kultiviert in den Bioreaktor mit oder ohne pulsatile Stimulation für bis zu 12 Wochen geimpft. Es gibt vier Attribute, die unsere Bioreaktor von einigen Vorgängern unterscheiden. 1) Im Gegensatz zu anderen Kultur-Systemen, die nur simulieren die biochemische Umgebung von nativen Blutgefäßen, unsere Bioreaktor erzeugt auch eine physiologische pulsatile Umwelt durch die Anwendung zyklische radiale Belastung der Gefäße in der Kultur. 2) Mehrere technisch Schiffe können gleichzeitig unter verschiedenen mechanischen Bedingungen innerhalb einer kontrollierten chemischen Umgebung kultiviert werden. 3) Der Bioreaktor ermöglicht eine Mono-Schicht von Endothelzellen (EC), um einfach auf der luminalen Seite von Engineered Schiffe für die Tier-Implantation Modelle beschichtet werden. 4) Unsere Bioreaktor können auch Kultur entwickelt Schiffen mit unterschiedlichem Durchmesser Größe reichte von 1 mm bis 3 mm, wodurch der Aufwand für maßgeschneiderte einzelnen Bioreaktor zu einem bestimmten Durchmesser passen.
Das konstruierte Schiffe in unserem Bioreaktor kultiviert ähneln nativen Blutgefäßen histologisch zu einem gewissen Grad. Zellen in der Gefäßwand ausdrücken reifen SMC kontraktilen Marker wie glatte Muskulatur Myosin heavy chain (SMMHC) 3. Eine erhebliche Menge an Kollagen in der extrazellulären Matrix, die für ultimative mechanische Festigkeit des konstruierten Schiffen 5 ist hinterlegt. Die biochemische Analyse zeigt auch, dass Kollagen-Gehalt von technischen Schiffe ist vergleichbar mit dem nativen Arterien 6. Wichtig ist, dass die pulsatile Bioreaktor konsequent Schiffe, die mechanischen Eigenschaften, die erfolgreiche Implantation Experimente erlauben in Tiermodellen 3,7 aufweisen regeneriert. Darüber hinaus kann dieses Bioreaktors weiter modifiziert werden, um Echtzeit-Beurteilung und Verfolgung von Kollagen Remodeling im Laufe der Zeit, nicht-invasiv mit Hilfe eines nicht-linearen optischen Mikroskopie (NLOM) 8 zu ermöglichen. Zum Abschluss sollte diese Bioreaktor als eine hervorragende Plattform, um die grundlegenden Mechanismen, die die Regeneration von funktionellen kleinem Durchmesser Gefäßprothesen regulieren Studie dienen.
Protocol
Autoclave
Montieren und Autoklaven den Schlauch für die Flow-System und Bioreaktor Komponenten (Bioreaktor selbst und die Silikonstopfen Deckel), wie in Abbildung 1 und Abbildung 2 angewiesen. Einfüllöffnung hat einen Stecker an einem Ende und einem offenen Ende auf der anderen Seite. Drei kurze Schläuche Segmente sind durch eine Silikonkappe für den Gasaustausch eingefügt.
1. Sewing PGA Mesh-
- Cut PGA Mesh 1.1cm x ~ 8cm Blatt (abhängig von Bioreaktor-Größe).
- Saubere Silikonschlauch (3mm Innendurchmesser) mit destilliertem Wasser (20 Dh) und an der Luft trocknen, bevor Gebrauch.
- Verwenden Sie Dexon 6,0 Naht zu PGA Mesh um den sauberen Silikonschlauch beginnend mit drei chirurgische Knoten durch einzelne Stiche folgten nähen.
2. PGA Gerüste Oberflächentechnik
- Dip PGA Gerüste in 1M NaOH für 1-2min und notieren Sie die Behandlungszeit und die gleichzeitig für alle PGA Gerüsten.
- Spülen PGA Gerüste in dH2O Bäder für 2 Minuten 3 mal.
- Pat PGA Gerüste trocken mit Kimwipes zwischen jedem Eintauchen in dH 2 O Bäder.
- Dry PGA Gerüste unter Gewebekultur Haube an der Luft für 15 Minuten mit Gebläse auf dem Trockenen.
3. Sewing Dacron Arme
- Verwenden Sie Prolene 4,0 Naht in kleine Stücke von Dacron Manschetten (1cm) an jedes Ende der PGA Mesh mit einer Überlappung von 2-3mm zu nähen. Hinweis: Achten Sie darauf, Punktion Silikonschlauch (Abbildung 3).
- Verwenden Sie die gleiche Naht zu drei Stiche rund um das freie Ende des Dacron Manschetten nähen. Achten Sie darauf, genug Nähte an den freien Enden der Prolene Naht für Schritt 5,1 (Abbildung 3) zu verlassen.
4. Versammlung der Bioreaktor (Tag vor Beginn des Bioreaktors Kultur)
- Soak genäht Mesh und Silikonschlauch, chirurgische Instrumente und einen dünnen Draht in einer 70% igen Ethanol-Bad für 20-30 Minuten.
- Öffnen des Autoklaven Beutel mit dem Bioreaktor und tauchen Sie es in 70% Ethanol-Bad für mindestens 30 Minuten vor der Montage. Achten Sie darauf, in den Bioreaktor gründlich mit Ethanol. Exposure aller Bioreaktor Komponenten zu 70% Ethanol ist eine Ergänzung der Sterilisation Schritt. Dieser Schritt entfernt auch Endotoxin, die nicht durch Autoklavieren entfernt und ist schädlich für den Gefäßzellen.
- Pull Silikonschlauch durch Seitenarme mit dünnen Draht, um es durchzuziehen.
- Nehmen Bioreaktor von Ethanol-Bad (keep Mesh in Ethanol getaucht). Fix der PGA Gerüst im Inneren des Bioreaktors durch Befestigung Dacron Manschetten über die ausgestellten Glas die Lippen durch das Anziehen und Verzurren der Prolene Naht (Abb. 3).
- Schließen Sie eine Seite des Bioreaktors Seitenarme zu Anschlüssen via Silikonschlauch.
- Ziehen Sie anderen Seite der Silikonschlauch mit genug Spannung und legen Sie die verbleibenden zwei Anschlüsse in Silikonschlauch. Halten Sie Silikonschlauch dicht beim Einlegen Anschlüsse!
- Setzen Sie Bioreaktor in Ethanol-Bad und bündig mit Ethanol durch vorsichtiges Ziehen Stecker aus der Seitenarme.
- Flip-Bioreaktor über und ermöglichen eine für 10 Minuten einweichen.
- Flip-Bioreaktor rechten Seite nach oben und genießen für weitere 10 Minuten.
- Lassen Sie alle Ethanol.
- Richten Sie drei große Petrischalen (10 cm) in Serie und Platz Bioreaktor in der Mitte Gericht zu halten das überschüssige Ethanol tropfte von den Enden der Röhren.
- Flush Bioreaktor und PGA Mesh mit Gewebekulturen Wasser mit einem 5ml oder 10ml Pipette. Auch bündig Gewebekultur Wasser in Silikonschlauch.
- Gut abtropfen lassen alles überschüssige Wasser in Petrischalen auf beiden Seiten des Bioreaktors.
- Dry Bioreaktor über Nacht in Kapuze mit Gebläse-und UV-OFF.
- Zusätzliche Hinweise: Achten Sie darauf sterile Rührstab wird im Bioreaktor. Achten Sie darauf, nicht zu "schweben" über den Bioreaktor von diesem Punkt an, um Verunreinigungen zu vermeiden. Cut up viel Parafilm-Streifen und genießen sie in einem kleinen 70% Ethanol-Bad (große Petrischale gut funktioniert).
5. Tag 1: Bioreaktor-Setup
- Legen Sie eine sterile Petrischale über die Öffnung der einzelnen Bioreaktor zur PGA Gerüst im Inneren von Verunreinigungen zu schützen.
- Montieren Sie Flow-System zum Bioreaktor, wie in Abbildung 4 und Parafilm alle Anschlussfugen angegeben.
- Wipe-Anschlüsse zunächst mit Alkohol wischt.
- Bringen Sie Injektionsport an Dritte, unbenutzt Arm des Bioreaktors.
- Entfernen Walross Schläuche und binden Sie das blaue Ende des Kochsalzlösung verdünnt so nah an Y-Kreuzung wie möglich einzustellen. Pull Schlauchklemme in Ort, um keine Flüssigkeit zu übertragen, um diesen Teil des Rohres gewährleistet
- Entfernen IV Tasche, und legen Walross-Schlauch (rot) bis weit Ende der IV-Beutel. Vergewissern Sie sich, um das Einführen Port mit Alkoholtupfer abwischen zuerst.
- Bringen Sie Walross auf einer Seite des Flow-System (via weißen Ende Rohr).
- Legen Sie 3-Wege-Hahn in Flow-System.
- Entfernen Druckaufnehmer & connect zum Dreiwegehahn.
- Bringen Sie anderen Ende der Druckaufnehmer mittlere Öffnung in der Tasche.
- VerbindenBioreaktor, um den Fluss über das Y-Kreuzung. Verwenden Sie eine 60ml Spritze mit 350ml von 1% Fungizone (mix 5ml Fungizone mit 495ml PBS) bis IV Tasche hinzuzufügen.
- Squeeze IV Tasche, um die fließenden System durch Anpassung der Hähne zu fließen von PBS ermöglichen Flush. Hinweis: Prüfen Sie im Bioreaktor zu gewährleisten, gibt es keine undicht.
- Re-suspend 8 x10 6 SMCs (etwa ein konfluenten T75) in 1,25 ml des Mediums und Samen auf jedes PGA scafffold. Stellen Sie sicher, Zellsuspension wurde gleichmäßig tropfte auf den PGA Mesh-Dacron Kreuzung als auch auf der unteren Seite der PGA Mesh.
- Wischen Rand des Bioreaktors mit Alkohol über rotierende Bioreaktor seitwärts vermeiden schweben zu wischen.
- Silikon-Stopfen Deckel Montage (Abbildung 2)
- Peel Autoklavierbeutel wieder sorgfältig, um sicher nicht nach unten Deckel freizulegen.
- Bringen Sie Injektionsport zu Magensonde am Stecker.
- Bringen Sie PTFE 0,20 um Filter zu jedem der drei Luft-Anschlüsse.
- Achten Sie darauf, nicht zu entlarven / touch unteren Deckel während dieses Prozesses.
- Parafilm der Einspritzöffnung.
- Legen Sie die Silikonstopfen Deckel in Glas-Bioreaktor und stellen Sie sicher, dass die Magensonde im Inneren des Bioreaktors nicht berührt ausgesät PGA Gerüsten. Parafilm um den Deckel.
- Legen Sie Bioreaktor mit dem Flow-System innerhalb des Inkubators (auf der Seite), und drehen Sie den Bioreaktor alle 5 Minuten für 25-30 Minuten.
- Füllen Sie den Bioreaktor Kammer mit 400ml unserer 4-10 Kulturmedien wie beschrieben (Tabelle 1). Das Kulturmedium wird "optimiert" für Schweine entwickelt Arterien.
6. Tag 6-7: Einschalten der Pumpe, und die ersten Fütterung
- Wachsen die Samen Gerüste statisch ohne pulsatile Pumpen durch den Silikonschlauch für 6-7 Tage. Es besteht keine Notwendigkeit für mittlere ändern oder Vitamin-C-Supplementation während dieser Zeit.
- Achten Sie darauf, keine Lecks vorhanden sind von PBS oder Knicken der Flow-System Schlauch vor dem Einschalten der Pumpe.
- Schalten Sie die Pumpe des Flow-System und stellen Sie sicher, Einstellung der Pumpe so einstellen, dass der Druck etwa 270/-30mmHg liest.
- Rekord Druck täglich während der Kultur und halten den Druck auf 270/-30mmHg. Druckmessumformer kann mit einem Computer zu lesen und zu überwachen den Druck angeschlossen werden.
Erste Fütterung
- Montieren Injektionsport & PTFE-Filter auf Futterdeckel sowohl für mittlere Veränderung und mittlere Abfall Absetzung Zwecke.
- Legen Sie die Magensonde fest auf die Pumpe und stecken Sie das eine Ende der Fütterung Port des Bioreaktors und das andere Ende an die Fütterung Deckel. Achten Sie darauf, die Einspritzöffnungen mit Ethanol Tücher zu wischen.
- Verwenden Sie einen bidirektionalen Masterflex-Pumpe zu Pumpe aus 200 ml Medium. Dann verwenden Sie eine neue Magensonde zu 200 ml frischem Medium zurück Pumpe in den Bioreaktor. Immer mit einer sehr langsamen Geschwindigkeit zu starten, besonders wenn Fördermedium zurück in den Bioreaktor.
- Ändern Sie mittel-und Ergänzung Ascorbinsäure 2x/Woche. Um Ascorbinsäure, verwenden Sie eine 30ml Spritze nehmen Sie 25ml des Mediums und legen Sie es beiseite in das Gewebe Kapuze. Lösen Sie 25 mg Ascorbinsäure in 5 ml PBS und filtern es durch ein 0,22 um-Filter. Zunächst injizieren die sterile Ascorbinsäure in die Magensonde und fügen wieder die 25ml Medium aus früheren übernommen. Das Medium Rezept ist in Tabelle 1 angegeben.
7. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Die Schläuche und Anschlüsse für die Flow-System Montage ist oben abgebildet.
Abbildung 2. Die Silikon-Stopfen Deckel Montage ist oben abgebildet.
Abbildung 3. Schematische Darstellung Bioreaktor Montage sind oben gezeigt. Im Bioreaktor Dacron Manschetten auf das Glas Arme mit dem blauen Faden Knoten befestigt sind.
Abbildung 4. Flow-System angeschlossenen Schläuchen und Bioreaktor ist oben gezeigt. L/S18 Schlauch durch eine Masterflex Pumpe gepumpt werden und damit Motor für die Strömung. Der Drucksensor wird der Druck vor dem Eintritt in den Bioreaktor am oberen Strom zu messen.
Abbildung 5. Image of geerntet entwickelt Schiff. Engineered Schiffe erscheinen undurchsichtig sein und erreichen eine Wandstärke von ca. 250μm nach 8-Wochen-Kultur unter pulsatilen Bedingungen.
Abbildung 6. Hämatoxylin und Eosin gefärbten Querschnitten konstruiert Gefäßen. A und B sind 8-wöchigen ungepulsten und gepulste Lymphgefäße.C und D sind 4-Wochen-ungepulsten und gepulste Lymphgefäße. L zeigt der luminalen Seite der Gefäße. Die Skalen bar ist 100 um.
Abbildung 7. Masson Flecken für Kollagen (blau) für Querschnitte von technischen Schiffe. A und B sind 8-wöchigen ungepulsten und gepulste Lymphgefäße. C und D sind 4-Wochen-ungepulsten und gepulste Lymphgefäße. Beachten Sie, dass der 4-wöchigen gepulsten Schiff mehr Kollagen als die nicht-gepulsten Gegenstück zeigt. Weiße Pfeile zeigen auf verbleibende PGA-Fragmente in den Gefäßen. Die Skalen bar ist 100 um.
Abbildung 8. Immunochemistry Färbung von SMC Markern bei Rindern entwickelt Arterien. Glatte Muskelzellen α-Aktin, Calponin-1 und der glatten Muskulatur Myosin heavy chain (SMMHC) sind frühe, mittlere und späte SMC kontraktilen Marker jeweils. Bis zum Ende des 12-Wochen-Kultur, die Zellen in der Gefäßwand ausdrücken SM α-Aktin und moderate Mengen an Calponin-1 und SMMHC. Die Waage-Bar ist 20 um.
| Komponente | Betrag |
| DMEM (DME / low modifiziert) | 500 ml |
| FBS (fötales Rinderserum) hitzeinaktiviertem | 100 ml |
| HEPES 1,0 M | 5ml |
| Vitamin C (gelöst in PBS oder DMEM) | 25 mg |
| Proline / Glycin / Alanin 25 mg/25 mg/10 mg (gelöst in 5 ml PBS) | 5ml |
| CuSO 4 1,5 pg (gelöst in1 ml PBS) | 1ml |
| Penicillin G auf 10.000 Einheiten / ml | 5ml |
| PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB) bei 10ng/ml | 5μg |
| bFGF (basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor) bei 10ng/ml | 5μg |
Tabelle 1. Komponenten von "4-10" Medium sind in der obigen Tabelle dargestellt. Mit Ausnahme von PDGF-BB und bFGF, sind alle anderen Komponenten durch eine 0,2 um-Filter vor dem Gebrauch gefiltert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Qualität der entwickelten Schiffe ist zu einem großen Teil von der Qualität der SMCs in Gewebekultur verwendet diktiert. Die kritischen Aspekte der SMC Phänotyp gehören kontraktilen Morphologie, niedrigen Durchgang Nummer, und die Fähigkeit, im Inneren des Bioreaktors vermehren. Wir empfehlen, dass die Passage Zahl nicht größer als P3 werden zum Zeitpunkt der Zellaussaat auf die Polymer-Gerüst. Darüber hinaus ist es von entscheidender Bedeutung, um zu bestätigen, dass die SMC Quellen Mykoplasmen frei vor dem Gebrauch. Wir haben beobachtet, dass Mykoplasmen-kontaminierten Zellen zu erheblichen Rückgänge in zelluläre Proliferation und Kollagen-Matrix Ablagerung in Bioreaktor Kultur führen.
Mehr als 400.000 koronare Transplantate sind für Bypass-Operationen müssen jedes Jahr, was zu einer hohen Nachfrage nach kleinem Durchmesser (<6mm) Gefäßprothesen 12. Das ultimative Ziel ist es, funktionale kleinem Durchmesser Schiffe, die die physiologischen Funktionen von nativem Gewebe nachahmen Ingenieur. Unsere pulsatile Bioreaktor-System ist eine vielversprechende bedeuten funktionelle arterielle Grafts, dass Wiederherstellung und Ersatz erkrankten Arterien darstellen könnte. In einem chemisch und mechanisch kontrollierten Umgebung, ermöglicht den Bioreaktor uns implantierbare kleinem Durchmesser Gefäße, starke Naht Retention und hervorragende mechanische Eigenschaften aufweisen Ingenieur. Die pulsatile Bioreaktor-System kann verwendet werden, um Arterien von Rindern 3, Schweine 6,7 und menschlichen Zellen 9 rekonstruieren in verschiedenen Größen und Abmessungen, wodurch dieses System verallgemeinerbar und vielseitig sein. Darüber hinaus haben wir unsere Bioreaktor modifiziert werden, um Echtzeit-Bildgebung des vaskulären extrazellulären Matrix, nicht-invasiv 8 zu ermöglichen. Ein kombinierter Ansatz unseres Bioreaktors, nicht-invasive bildgebende Verfahren der Mikroskopie und innovative biomechanische Beurteilung wird uns helfen, zu verstehen und zu bewerten ECM Abscheidung und die Veränderungen in der Gefäß-mechanischen Eigenschaften über die Zeit.
Daher stellt diese Bioreaktor-System einen einzigartigen Ansatz zur biologisch-basierten Gefäßprothesen Ingenieur, der eine wichtige Rolle bei der autologen Gefäßersatz Regeneration spielen können in zukünftigen klinischen Anwendungen 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von den National Institutes of Health Grants R01 EB-008836 und R01 HL083895 finanziert (beide LEN). Wir könnten gerne Daryl Smith, der Universität Glasbläser, für die Herstellung der Bioreaktoren für unsere Forschung zu danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS (Fetal Bovine Serum) Heat-Inactivated | Hyclone | SH30071 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| rhFGF-basic | R&D Systems | 234-FSE | |
| rrPDGF-BB | R&D Systems | 520-BB | |
| Penicilin G | Sigma-Aldrich | PENNA | |
| Copper(II) Sulfate | Sigma-Aldrich | C8027 | |
| Gylcine | Sigma-Aldrich | C8790 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-25G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Silicone Stopper | Cole-Parmer | 06298-24 | |
| Masterflex tubes L/S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 | |
| Masterflex pump | Cole-Parmer | 7553-80 | |
| Dacron cuff | Maquet | 174406 | |
| PGA felt | Concordia | MO000877-01 | |
| 4-0 1.5 metric Surgipro II suture | Syneture | VP-557-X | |
| 6-0 0.7 metric Dexon suture | Syneture | 7538-11 | |
| 0.22μm PTFE filters | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
| Three Way Stop-cock | Edwards Lifesciences | 593WSC | |
| Pressure Transducer | Edwards Lifesciences | PX212 | |
| IV bags | Baxter Internationl Inc. | R4R2110 | |
| Saline dilution set | Arrow International | W20030 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain | F05027 |
References
- Risau, W., Flamme, I.
- Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion. Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).
- Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R.
- Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).
- Mitchell, S. L., Niklason, L. E. Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts. Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).
- Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries. Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).
- Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).
- Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valentín, A., Humphrey, J. D. Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).
- Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -c, Krause, D., Niklason, L. E. Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).
- Gong, Z. D., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs. Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).
- Poh, M. Blood vessels engineered from human cells. Lancet. 365, 2122-2124 (2005).
- American Heart Association. Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , American Heart Association. (2002).
