Summary
Il nostro gruppo ha sviluppato un sistema di coltura bioreattore che imita lo stress pulsatile fisiologica del sistema cardiovascolare per rigenerare impiantabili protesi vascolari di piccolo diametro.
Abstract
Molti sforzi sono stati dedicati a sviluppare e far progredire la metodologia per la rigenerazione funzionale di piccolo diametro bypass arterioso. In ambiente fisiologico, sia la stimolazione meccanica e chimica sono tenuti a mantenere il corretto sviluppo e la funzionalità dei vasi arteriosi 1,2.
Sistemi di coltura bioreattore sviluppato dal nostro gruppo sono stati progettati per sostenere la rigenerazione all'interno di una nave controllata con precisione chemio-meccanico ambiente imitando quella dei vasi nativi. La nostra assemblea bioreattori e procedure di manutenzione sono abbastanza semplici e altamente ripetibili 3,4. Cellule muscolari lisce (SMC) sono seminate su un acido poliglicolico tubolare (PGA) maglia che viene infilato nel tubo in silicone compatibile e colta nel bioreattore, con o senza stimolazione pulsatile per un massimo di 12 settimane. Ci sono quattro caratteristiche principali che contraddistinguono la nostra bioreattore da alcuni predecessori. 1) A differenza di altri sistemi di coltura che simulano soltanto la biochimica dei vasi sanguigni circostanti nativi, il nostro bioreattore crea anche un ambiente fisiologico pulsatile applicando ciclica deformazione radiale dei vasi nella cultura. 2) Più imbarcazioni progettate possono essere coltivate simultaneamente in diverse condizioni meccaniche all'interno di un ambiente chimiche controllate. 3) Il bioreattore permette una mono strato di cellule endoteliali (CE) per essere facilmente rivestiti sul lato luminale dei vasi progettato l'impianto per i modelli animali. 4) Il nostro bioreattore può anche recipienti di coltura progettata con dimensioni di diverso diametro varia da 1 mm a 3 mm, risparmiando lo sforzo di adattare ogni singolo bioreattore per adattarsi a una dimensione specifica diametro.
I vasi progettati colta nel nostro bioreattore assomigliano vasi sanguigni nativo istologicamente in una certa misura. Cellule nelle pareti dei vasi esprimere maturo marcatori SMC contrattili come catena pesante della miosina del muscolo liscio (SMMHC) 3. Una notevole quantità di collagene si deposita all'interno della matrice extracellulare, che è responsabile per la massima resistenza meccanica dei vasi progettati 5. Analisi biochimica indica anche che il contenuto di collagene dei vasi ingegnerizzati è paragonabile a quella delle arterie native 6. È importante sottolineare che il bioreattore pulsatile ha costantemente rigenerato navi che presentano proprietà meccaniche che permettono l'impianto esperimenti di successo in modelli animali 3,7. Inoltre, questo bioreattore può essere ulteriormente modificato per consentire in tempo reale valutazione e monitoraggio del rimodellamento del collagene nel corso del tempo, non invasivo, usando una non lineare microscopia ottica (NLOM) 8. Per concludere, questo bioreattore dovrebbe servire come una piattaforma eccellente per studiare i meccanismi fondamentali che regolano la rigenerazione funzionale di protesi vascolari di piccolo diametro.
Protocol
Autoclave
Assemblare e autoclave i tubi per il sistema di flusso e dei componenti bioreattore (bioreattore stesso e il coperchio tappo in silicone), come indicato in Figura 1 e Figura 2. Tubo di alimentazione ha un connettore maschio da un lato e una fine aperta sull'altro lato. Tre segmenti di tubo corto vengono inseriti attraverso un tappo in silicone per lo scambio di gas.
1. Cucire PGA Mesh
- Tagliare PGA mesh per 1,1 centimetri x ~ fogli da 8 cm (a seconda della dimensione bioreattore).
- Tubi di silicone pulito (3 mm di diametro interno) con acqua distillata (dH20) e asciugare prima dell'uso.
- Usa Dexon 6,0 sutura a cucire PGA mesh attorno al tubo di silicone pulito a partire da tre nodi chirurgica seguita da singoli punti di sutura.
2. PGA Ponteggi Trattamento delle superfici
- Dip ponteggi PGA in NaOH 1M per 1-2min e registrare il tempo di trattamento e l'uso stesso tempo per tutti i ponteggi PGA.
- Sciacquare ponteggi PGA nei bagni dH2O per 2 minuti 3 volte.
- Pat PGA ponteggi a secco con Kimwipes tra ogni tuffo nella dH O 2 bagni.
- Secco PGA ponteggi sotto il cofano di coltura tissutale asciugare all'aria per 15 minuti con il ventilatore.
3. Braccia Dacron da cucire
- Usa Prolene sutura 4,0 a cucire piccoli pezzi di polsini Dacron (1 cm) su ogni estremità della rete PGA con una sovrapposizione di 2-3mm. Nota: non stare attento a forare tubi di silicone (Figura 3).
- Utilizzare la sutura stessa a cucire tre punti verso la fine senza polsini Dacron. Assicurarsi di lasciare abbastanza suture alle estremità libera di sutura Prolene per la fase 5.1 (Figura 3).
4. Assemblea dei bioreattori (giorno prima dell'inizio della cultura bioreattore)
- Immergere maglia cucita e tubi in silicone, strumenti chirurgici, e un filo sottile in un bagno di etanolo al 70% per 20-30 minuti.
- Aprire i sacchetti autoclave contenente il bioreattore e immergerlo in bagno etanolo al 70% per almeno 30 minuti prima del montaggio. Assicurarsi di lavare il bioreattore a fondo con l'etanolo. L'esposizione di tutti i componenti bioreattore al 70% di etanolo è un passo oltre la sterilizzazione. Questa operazione rimuove anche endotossina, che non viene rimosso in autoclave ed è nociva per le cellule vascolari.
- Tirare tubo in silicone con bracci laterali con filo sottile di tirare fino in fondo.
- Prendete bioreattore da bagno etanolo (tenere in rete sommersa in etanolo). Fissare il patibolo PGA all'interno del bioreattore serrando polsini Dacron sopra le labbra bicchiere svasato stringendo e legando le suture Prolene (Figura 3).
- Collegare un lato di armi bianche bioreattore ai connettori tramite tubo in silicone.
- Tirare dall'altra parte di tubo in silicone con tensione sufficiente e inserire i restanti due connettori in tubo in silicone. Mantenere il tubo in silicone strettamente quando si inseriscono i connettori!
- Bioreattore reinserire in bagno a filo con etanolo e l'etanolo tirando delicatamente connettori fuori dei bracci laterali.
- Capovolgere bioreattore più e consentono un ammollo per 10 minuti.
- Bioreattore flip lato destro in alto e prendere per altri 10 minuti.
- Scaricare tutto l'etanolo.
- Creato tre grandi piatti di Petri (10 cm) in serie e bioreattori posto nel piatto centrale a tenere l'etanolo in eccesso gocciolava dalle estremità dei tubi.
- Flush bioreattori e PGA rete con acqua di coltura con una pipetta da 5 ml o 10 ml. Anche a livello della cultura dell'acqua presente nei tessuti in tubo in silicone.
- Accuratamente tutta l'acqua di scarico in eccesso in piastre Petri su entrambi i lati del bioreattore.
- Bioreattore asciugare durante la notte in cappa con ventilatore acceso e spento UV.
- Note aggiuntive: assicurarsi ancoretta sterile è in bioreattore. Fare attenzione a non "hover" sopra il bioreattore da questo punto in avanti, per evitare contaminazioni. Tagliare un sacco di strisce parafilm e ammollo in una piccola vasca etanolo al 70% (grandi Petri funziona bene).
5. Giorno 1: installazione Bioreattore
- Inserire una piastra di Petri sterile oltre all'apertura di ogni bioreattore per proteggere l'interno PGA patibolo da sostanze contaminanti.
- Assemblare sistema a flusso di bioreattore come indicato in Figura 4 e parafilm tutti i giunti di collegamento.
- Pulire i connettori prima con cotone imbevuto di alcol.
- Fissare porta di iniezione a terzi, braccio inutilizzati di bioreattore.
- Rimuovere il tubo di tricheco e legare fine blu della diluizione salina impostato come vicino al raccordo a Y possibile. Tirare fascetta in atto per garantire l'assenza di trasferimento di liquidi a questa parte del tubo
- Rimuovere borsa IV, e allegare tubi tricheco (rosso) di gran lunga fine di borsa IV. Assicurarsi di pulire porta di inserimento con batuffolo imbevuto di alcool prima.
- Attaccare tricheco da un lato del sistema di flusso (tramite tubo estremità bianca).
- Inserire 3-way rubinetto nel sistema di flusso.
- Rimuovere trasduttore di pressione e la connessione a tre vie rubinetto.
- Collegare altra estremità del trasduttore di pressione per l'apertura centrale nella borsa.
- Collegareil bioreattore al sistema che attraverso lo Y-giunzione. Utilizzare una siringa da 60 ml per aggiungere 350ml di 1 Fungizone% (5 ml Fungizone mescolare con 495ml di PBS) per borsa IV.
- Spremere borsa IV per sciacquare il sistema che scorre regolando la rubinetti arresto per consentire il flusso di PBS. Nota: controllare all'interno bioreattore per assicurare che non si perde.
- Risospendere 8 x10 6 SMC (circa un confluenti T75) in 1.25ml di medie e di semi su ogni scafffold PGA. Assicurarsi sospensione cellulare è stata uniformemente sgocciolava sul reticolo Dacron giunzione PGA così come sul lato inferiore del PGA mesh.
- Pulire bordo del bioreattore con batuffolo imbevuto d'alcol attraverso la rotazione del bioreattore lateralmente evitare bilico.
- Coperchio tappo in silicone di montaggio (Figura 2)
- Peel borsa autoclave indietro attentamente, facendo attenzione a non esporre fondo del coperchio.
- Fissare porta di iniezione a tubo di alimentazione al connettore maschio.
- Allega PTFE 0,20 micron filtri a ciascuna delle tre porte d'aria.
- Fare attenzione a non esporre / toccare il fondo del coperchio durante questo processo.
- Parafilm la porta di iniezione.
- Inserire il coperchio tappo in silicone in bioreattore in vetro e assicurarsi che il tubo di alimentazione all'interno del bioreattore non tocca la ponteggi PGA seminato. Parafilm tutto il coperchio.
- Luogo bioreattore con il sistema di flusso all'interno dell'incubatore (su un lato) e ruotare il bioreattore ogni 5 minuti per 25-30 minuti.
- Riempire la camera bioreattore con 400 ml del nostro 4-10 terreni di coltura, come descritto nella (Tabella 1). Questo terreno di coltura è "ottimizzato" per le arterie suina ingegnerizzati.
6. Giorno 6-7: Accensione della pompa, e prima alimentazione
- Crescono i ponteggi seminato staticamente senza pulsatile di pompaggio attraverso il tubo in silicone per 6-7 giorni. Non c'è bisogno di cambiare mezzo o la supplementazione di vitamina C durante questo periodo.
- Assicurarsi che non vi siano perdite di PBS o attorcigliamento del tubo di flusso del sistema prima di attivare la pompa.
- Accendere la pompa del sistema di flusso e assicurarsi di regolare le impostazioni della pompa in modo che la pressione si legge circa 270/-30mmHg.
- Pressioni registrare ogni giorno in tutta la cultura e mantenere la pressione a 270/-30mmHg. Trasduttore di pressione può essere collegato a un computer per leggere e monitorare la pressione.
Alimentazione prima
- Montare iniezione indiretta e PTFE filtro sulla alimentazione coperchi sia per il cambiamento medio e medio deposal scopi rifiuti.
- Posizionare il tubo di alimentazione saldamente sulla pompa e inserirne l'estremità all'alimentazione porta del bioreattore e l'altra estremità al coperchio di alimentazione. Assicurarsi di pulire le porte di iniezione con salviette etanolo.
- Utilizza un processore dual-direzionale pompa Masterflex per pompare fuori 200 ml di mezzo. Quindi utilizzare un nuovo tubo di alimentazione alla pompa 200 ml di terreno fresco di nuovo nel bioreattore. Iniziano sempre con una velocità molto lenta, soprattutto quando si pompano ritorno medio del bioreattore.
- Cambiamenti a medio e acido ascorbico 2x/sett supplemento. Per aggiungere acido ascorbico, utilizzare una siringa 30ml per eliminare 25ml di media e riporla nel cappuccio di tessuto. Sciogliere 25 mg di acido ascorbico in 5 ml di PBS e filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron. In primo luogo iniettare l'acido ascorbico sterile nel tubo di alimentazione e aggiungere nuovamente il medium 25ml presi in precedenza. La ricetta di media è riportata nella Tabella 1.
7. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. I tubi e connettori per l'assemblaggio del sistema di flusso è mostrato sopra.
Figura 2. Il tappo in silicone montaggio coperchio è mostrato sopra.
Figura 3. Schemi di montaggio bioreattore sono indicati sopra. All'interno del polsini Dacron bioreattore sono fissati sulle braccia di vetro con i nodi di sutura blu.
Figura 4. Sistema a flusso collegato a tubi e bioreattore è mostrato sopra. L/S18 tubi sarà pompata da una pompa Masterflex e quindi guida il flusso. Il trasduttore di pressione misura la pressione prima di entrare nel bioreattore a flusso superiore.
Figura 5. Immagine di raccolta nave progettata. Vasi Progettato apparirà opaco e raggiungere uno spessore di circa 250μm dopo 8 settimane di cultura in condizioni pulsatile.
Figura 6. Ematossilina ed eosina macchiato sezioni trasversali dei vasi ingegnerizzati. A e B sono di 8 settimane non-pulsato e pulsata navi, rispettivamente.C e D sono vasi non-pulsato e ad impulsi di 4 settimane, rispettivamente. L indica il lato del lume dei vasi. La barra di scala è 100μm.
Figura 7. Masson tricromica macchie per il collagene (blu) per le sezioni trasversali dei vasi ingegnerizzati. A e B sono 8 settimane di imbarcazioni non a impulsi e ad impulsi, rispettivamente. C e D sono vasi non-pulsato e ad impulsi di 4 settimane, rispettivamente. Si noti che le 4 settimane di nave pulsata mostra più collagene rispetto al suo non-pulsato controparte. Frecce bianche indicano ancora frammenti PGA nei vasi. La barra di scala è 100μm.
Figura 8. Colorazione immunochimica dei marcatori SMC nei bovini arterie artificiali. Muscolo liscio α-actina, calponina-1, e liscia la catena pesante della miosina muscolare (SMMHC) sono primi, intermedio e in ritardo marcatori SMC contrattile, rispettivamente. Entro la fine di 12 settimane di cultura, le cellule della parete dei vasi esprimere SM α-actina e moderate quantità di Calponin-1 e SMMHC. La barra di scala è 20μm.
| Componente | Quantità |
| DMEM (DME / bassa modificato) | 500 ml |
| FBS (siero fetale bovino) inattivato con il calore | 100 ml |
| HEPES 1,0 M | 5ml |
| Vitamina C (sciolto in PBS o DMEM) | 25 mg |
| Proline / Glycine / Alanina 25 mg/25 mg/10 mg (sciolta in 5 ml di PBS) | 5ml |
| CuSO 4 1.5 mcg (sciolto in1 ml di PBS) | 1 ml |
| Penicillina G a 10.000 unità / ml | 5ml |
| PDGF-BB (derivato dalle piastrine fattore di crescita-BB) a 10ng/ml | 5μg |
| bFGF (fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti) a 10ng/ml | 5μg |
Tabella 1. Componenti di media "4-10" sono riportati nella tabella sopra riportata. Con l'eccezione di PDGF-BB e bFGF, tutti gli altri componenti devono essere filtrate attraverso un filtro 0.2μm prima dell'uso.
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Discussion
La qualità delle navi ingegneria è in gran parte dettata dalla qualità della SMC utilizzati in coltura. Gli aspetti critici del fenotipo SMC comprendono morfologia contrattile, numero passaggio basso, e la capacità di proliferare all'interno del bioreattore. Si raccomanda che il numero passaggio essere superiore a P3, al momento della semina di cellule sul patibolo polimero. Inoltre, è fondamentale per confermare che i sorgenti di SMC sono liberi micoplasma prima dell'uso. Abbiamo osservato che il micoplasma contaminati da cellule portare ad una sostanziale diminuzione nella proliferazione cellulare e la matrice deposizione di collagene nella cultura bioreattore.
Più di 400.000 innesti delle arterie coronarie sono necessità di operazioni di bypass ogni anno, con una conseguente forte domanda di piccolo diametro (<6 mm) innesti vascolari 12. L'obiettivo finale è quello di ingegnere funzionale vasi di piccolo diametro che simulano le funzioni fisiologiche del tessuto nativo. Il nostro sistema di bioreattori pulsatile è uno strumento promettente per costituire funzionale innesti arteriosi che potrebbe ripristinare e sostituire le arterie malate. In un ambiente chimicamente e meccanicamente controllato, il bioreattore ci permette di ingegnere impiantabili di piccolo diametro vasi che presentano una forte ritenzione di sutura ed eccellenti proprietà meccaniche. Il sistema di bioreattore pulsatile può essere utilizzato per ricostruire le arterie di bovini 3, suini 6,7, e 9 cellule umane in vari formati e dimensioni, rendendo questo sistema generalizzabile e versatile. Inoltre, abbiamo modificato il nostro bioreattore per consentire in tempo reale immagini di vascolare matrice extracellulare, in modo non invasivo 8. Un approccio combinato del nostro bioreattore, tecniche non invasive di imaging microscopia, e avanzate valutazioni biomeccaniche ci aiuterà a capire e valutare la deposizione di ECM e le variazioni vascolari caratteristiche meccaniche nel tempo.
Pertanto, questo sistema bioreattore fornisce un approccio unico alla ingegnere innesti vascolari biologico-based, che può giocare un ruolo importante nella rigenerazione vascolare innesti autologhi in futuro applicazioni cliniche 10,11.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è finanziato dal National Institutes of Health di Grant R01-EB 008836 e R01 HL083895 (sia per LEN). Si potrebbe ringraziare Daryl Smith, il Vetraio Università, per rendere il bioreattori per la nostra ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS (Fetal Bovine Serum) Heat-Inactivated | Hyclone | SH30071 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| rhFGF-basic | R&D Systems | 234-FSE | |
| rrPDGF-BB | R&D Systems | 520-BB | |
| Penicilin G | Sigma-Aldrich | PENNA | |
| Copper(II) Sulfate | Sigma-Aldrich | C8027 | |
| Gylcine | Sigma-Aldrich | C8790 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-25G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Silicone Stopper | Cole-Parmer | 06298-24 | |
| Masterflex tubes L/S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 | |
| Masterflex pump | Cole-Parmer | 7553-80 | |
| Dacron cuff | Maquet | 174406 | |
| PGA felt | Concordia | MO000877-01 | |
| 4-0 1.5 metric Surgipro II suture | Syneture | VP-557-X | |
| 6-0 0.7 metric Dexon suture | Syneture | 7538-11 | |
| 0.22μm PTFE filters | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
| Three Way Stop-cock | Edwards Lifesciences | 593WSC | |
| Pressure Transducer | Edwards Lifesciences | PX212 | |
| IV bags | Baxter Internationl Inc. | R4R2110 | |
| Saline dilution set | Arrow International | W20030 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain | F05027 |
References
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