Summary
हमारे समूह का एक bioreactor संस्कृति प्रणाली है कि हृदय प्रणाली के शारीरिक काँपने के गुणवाला तनाव implantable छोटे व्यास संवहनी grafts पुनर्जीवित करने के लिए mimics विकसित किया है.
Protocol
आटोक्लेव
इकट्ठा और प्रवाह प्रणाली और bioreactor घटकों (bioreactor खुद को और सिलिकॉन डाट ढक्कन) के रूप में चित्रा 1 और चित्रा 2 में निर्देश दिए के लिए टयूबिंग आटोक्लेव. दूध पिलाने की ट्यूब के एक छोर पर एक पुरुष संबंधक और दूसरी तरफ एक खुला अंत है. तीन खंडों कम टयूबिंग गैस आदान - प्रदान के लिए एक सिलिकॉन टोपी के माध्यम से डाला जाता है.
1. सिलाई पीजीए मेष
- कट पीजीए जाल 1.1cm x ~ 8cm पत्रक (bioreactor आकार पर निर्भर).
- आसुत (dH20) पानी और उपयोग से पहले शुष्क हवा के साथ साफ़ सिलिकॉन टयूबिंग (3mm भीतरी व्यास).
- Dexon 6.0 सीवन का उपयोग करने के लिए चारों ओर साफ सिलिकॉन तीन शल्य चिकित्सा एकल टांके के बाद गांठ के साथ शुरू टयूबिंग पीजीए जाल सीना.
2. पीजीए भूतल उपचार scaffolds
- 1-2min और इलाज समय रिकॉर्ड और सभी पीजीए scaffolds के लिए एक ही समय का उपयोग के लिए 1M NaOH में डुबकी पीजीए scaffolds.
- DH2O स्नान में 2 मिनट 3 बार के लिए पीजीए scaffolds कुल्ला.
- पैट पीजीए DH 2 हे स्नान में प्रत्येक डुबकी के बीच Kimwipes साथ सूखी scaffolds .
- टिशू कल्चर हुड के नीचे सूखी पीजीए scaffolds पर धौंकनी के साथ 15 मिनट के लिए शुष्क हवा.
3. सिलाई Dacron हथियार
- Prolene 4.0 सीवन का उपयोग करने के लिए 2-3mm के एक ओवरलैप के साथ पीजीए जाल के प्रत्येक के अंत पर Dacron कफ (1cm) के छोटे टुकड़े सिलाई. नोट: सावधान रहना पंचर सिलिकॉन टयूबिंग (चित्रा 3) के लिए नहीं है.
- Dacron कफ के मुक्त अंत के आसपास तीन टाँके सिलाई ही सीवन का प्रयोग करें. 5.1 कदम (चित्रा 3) के लिए Prolene सिवनी से मुक्त सिरों पर पर्याप्त sutures छोड़ सुनिश्चित करें.
4. Bioreactor की सभा (bioreactor संस्कृति की शुरुआत से पहले दिन)
- सिलना जाल और सिलिकॉन टयूबिंग, शल्य चिकित्सा उपकरणों, और एक पतले तार एक 70% इथेनॉल स्नान में 20-30 मिनट के लिए भिगोएँ.
- आटोक्लेव पहले कोडांतरण कम से कम 30 मिनट के लिए और यह 70% इथेनॉल स्नान में डूब bioreactor युक्त पाउच खोलें. इथेनॉल के साथ bioreactor अच्छी तरह से फ्लश करने के लिए सुनिश्चित करें. 70% इथेनॉल के लिए सभी bioreactor घटकों के एक्सपोजर एक अतिरिक्त नसबंदी कदम है. यह कदम भी endotoxin है, जो autoclaving द्वारा हटाया नहीं है और संवहनी कोशिकाओं के लिए हानिकारक है निकालता है.
- पतले तार का उपयोग कर इसे खींचने के माध्यम से पक्ष हथियारों के माध्यम से सिलिकॉन टयूबिंग खींचो.
- Bioreactor इथेनॉल स्नान के बाहर ले लो (इथेनॉल में डूबे हुए जाल रखने). Flared गिलास होठों से अधिक मजबूत और नीचे Prolene sutures (चित्रा 3) बांधने से Dacron कफ बन्धन द्वारा bioreactor अंदर पीजीए पाड़ को ठीक करें.
- सिलिकॉन टयूबिंग के माध्यम से connectors bioreactor पक्ष हथियारों की एक तरफ से कनेक्ट करें.
- काफी तनाव के साथ सिलिकॉन टयूबिंग की दूसरी ओर खींचो और सिलिकॉन टयूबिंग में शेष दो connectors के सम्मिलित है. सिलिकॉन टयूबिंग पर कसकर पकड़ जब कनेक्टर्स डालने!
- इथेनॉल स्नान में Reinsert bioreactor और धीरे connectors पक्ष हथियारों के बाहर खींच द्वारा इथेनॉल के साथ फ्लश.
- Bioreactor पलटें और अनुमति एक 10 मिनट के लिए लेना.
- फ्लिप bioreactor सही साइड और एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए लेना.
- सभी इथेनॉल नाली.
- और केंद्र पकवान में जगह bioreactor श्रृंखला में तीन बड़े पेट्री डिश (10 सेमी) सेट को पकड़ अतिरिक्त इथेनॉल ट्यूबों की छोर से dripped.
- टिशू कल्चर एक 5ml या 10ml पिपेट का उपयोग पानी के साथ bioreactor और पीजीए जाल फ्लश. इसके अलावा सिलिकॉन टयूबिंग में फ्लश टिशू कल्चर पानी.
- अच्छी तरह से bioreactor के दोनों तरफ पेट्री डिश में सभी अतिरिक्त पानी के निकास.
- सूखे पर धौंकनी और यूवी रवाना हुड में रातोंरात bioreactor.
- अतिरिक्त नोट: सुनिश्चित करें कि बाँझ हलचल बार bioreactor में है. Bioreactor अधिक इस बिंदु से आगे नहीं, "मंडराना" संक्रमण से बचने सुनिश्चित करें. बहुत सारे parafilm स्ट्रिप्स कट और उन्हें एक छोटे से 70% इथेनॉल स्नान (बड़े पेट्री डिश अच्छी तरह से काम करता है) में लेना.
5. दिन 1: bioreactor सेटअप
- प्रत्येक bioreactor contaminants से पीजीए पाड़ के अंदर की रक्षा के उद्घाटन पर एक बाँझ पेट्री डिश रखें.
- Bioreactor के प्रवाह प्रणाली इकट्ठा के रूप में चित्रा 4 और सभी कनेक्शन जोड़ों parafilm में संकेत दिया.
- शराब पोंछे के साथ पहली कनेक्टर्स पोछो.
- तीसरे, bioreactor की अप्रयुक्त हाथ इंजेक्शन बंदरगाह संलग्न.
- वालरस टयूबिंग निकालें और खारा कमजोर पड़ने के नीले अंत के रूप में संभव के रूप में वाई जंक्शन के करीब सेट टाई. ट्यूब के इस हिस्से के लिए कोई तरल हस्तांतरण सुनिश्चित करने के जगह में ट्यूब दबाना खींचो
- चतुर्थ बैग निकालें और चतुर्थ बैग के अंत तक वालरस टयूबिंग (लाल) देते हैं. पहली बार पोंछ शराब के साथ सम्मिलन बंदरगाह पोंछ करना सुनिश्चित करें.
- वालरस प्रवाह प्रणाली के एक तरफ करने के लिए संलग्न (सफेद अंत ट्यूब के माध्यम से).
- प्रवाह प्रणाली में 3 तरह पानी निकलने की टोंटी डालें.
- दबाव transducer निकालें और तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी कनेक्ट.
- बैग में मध्यम खोलने के लिए दबाव transducer के दूसरे छोर संलग्न.
- कनेक्टवाई जंक्शन के माध्यम से प्रवाह प्रणाली bioreactor. एक 60ml सिरिंज का प्रयोग चतुर्थ बैग 350ml 1% fungizone (पीबीएस के 495ml के साथ मिश्रण 5ml fungizone) जोड़ने के लिए.
- चतुर्थ बैग निचोड़ रोक लंड समायोजन पीबीएस के प्रवाह की अनुमति से बह सिस्टम फ्लश. नोट: bioreactor के अंदर जांच करने के लिए सुनिश्चित करें वहाँ कोई लीक कर रहा है.
- मध्यम और प्रत्येक पीजीए scafffold पर बीज की 1.25ml में 8 x10 6 SMCs (मिला हुआ T75 के बारे में एक) पुनः-निलंबित. सुनिश्चित करें कि समान कक्ष निलंबन किया गया है पीजीए जंक्शन जाल - Dacron पर पीजीए जाल के नीचे की ओर पर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से dripped.
- पोछो शराब के साथ bioreactor के रिम bioreactor घूर्णन बग़ल में मँडरा से बचने के माध्यम से पोंछ.
- सिलिकॉन डाट ढक्कन विधानसभा (चित्रा 2)
- ध्यान से वापस आटोक्लेव बैग पील, ढक्कन के नीचे नहीं बेनकाब करने के लिए सुनिश्चित करने.
- पुरुष संबंधक में खिला ट्यूब इंजेक्शन बंदरगाह संलग्न.
- हवा के तीन बंदरगाहों में से प्रत्येक के लिए PTFE 0.20 सुक्ष्ममापी फिल्टर संलग्न.
- बेनकाब नहीं है / इस प्रक्रिया के दौरान ढक्कन के नीचे स्पर्श करने के लिए सावधान रहें.
- इंजेक्शन बंदरगाह Parafilm.
- कांच bioreactor में सिलिकॉन डाट ढक्कन डालें और सुनिश्चित करें कि bioreactor अंदर खिला ट्यूब वरीयता प्राप्त पीजीए scaffolds के स्पर्श नहीं करता है. ढक्कन के आसपास Parafilm.
- इनक्यूबेटर अंदर प्रवाह प्रणाली (अपने पक्ष पर) के साथ bioreactor प्लेस और bioreactor बारी बारी से 25-30 मिनट के लिए हर 5 मिनट.
- हमारी संस्कृति 4-10 के रूप में वर्णित मीडिया (1 टेबल) 400ml के साथ bioreactor चैम्बर भरें. इस संस्कृति के माध्यम सुअर इंजीनियर धमनियों के लिए "अनुकूलित" है.
6. 6-7 दिन: पम्प पर टर्निंग, और सबसे पहले दूध पिलाने
- वरीयता प्राप्त scaffolds statically ग्रो किसी भी 6-7 दिनों के लिए सिलिकॉन टयूबिंग के माध्यम से पम्पिंग काँपने के गुणवाला बिना. मध्यम या इस समय के दौरान विटामिन सी अनुपूरण बदलने के लिए कोई ज़रूरत नहीं है.
- सुनिश्चित करें कि वहाँ पंप पर बदल से पहले पीबीएस या प्रवाह प्रणाली टयूबिंग की kinking का कोई लीक कर रहे हैं.
- प्रवाह प्रणाली के पंप पर मुड़ें और पंप सेटिंग समायोजित इतना है कि दबाव लगभग 270/-30mmHg पढ़ता करने के लिए सुनिश्चित करें.
- रिकॉर्ड संस्कृति भर में दैनिक दबाव और 270/-30mmHg पर दबाव बनाए रखने. दबाव transducer पढ़ने के लिए और दबाव की निगरानी के लिए कंप्यूटर से जुड़ा जा सकता है.
सबसे पहले दूध पिलाने
- दोनों मध्यम परिवर्तन और मध्यम बर्बाद deposal प्रयोजनों के लिए lids खिलाने पर इंजेक्शन बंदरगाह और PTFE फिल्टर इकट्ठे.
- पंप पर मजबूती से खिला ट्यूब प्लेस और bioreactor और खिला ढकने के लिए दूसरे छोर के बंदरगाह खिला एक अंत डालने. इथेनॉल पोंछे के साथ इंजेक्शन बंदरगाहों पोंछ करना सुनिश्चित करें.
- एक दोहरी दिशात्मक Masterflex पंप का प्रयोग करने के लिए माध्यम की 200ml पंप. फिर एक नया खिला ट्यूब का उपयोग करने के लिए ताजा माध्यम के 200ml bioreactor में वापस पंप. हमेशा एक बहुत ही धीमी गति के साथ शुरू है, खासकर जब bioreactor मध्यम वापस पंप.
- मध्यम और पूरक ascorbic एसिड 2x/week बदलें. Ascorbic एसिड जोड़ने के लिए है, एक 30ml सिरिंज का उपयोग करने के लिए माध्यम की 25ml ले और यह ऊतक हुड में अलग जगह. पीबीएस के 5ml में ascorbic एसिड के 25mg भंग और यह 0.22 फिल्टर सुक्ष्ममापी के माध्यम से फिल्टर. सबसे पहले खिला ट्यूब में बाँझ ascorbic एसिड इंजेक्षन और वापस बाहर पहले लिया 25ml मध्यम जोड़ने. मध्यम नुस्खा तालिका 1 में दिया जाता है.
7. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1. टयूबिंग और प्रवाह प्रणाली विधानसभा के लिए connectors के ऊपर दिखाया गया है.
चित्रा 2. सिलिकॉन डाट ढक्कन विधानसभा ऊपर दिखाया गया है.
चित्रा 3. Bioreactor विधानसभा के Schematics ऊपर दिखाए जाते हैं अंदर bioreactor Dacron कफ नीले सीवन गांठ के साथ कांच हथियार पर fastened हैं.
चित्रा 4. फ्लो टयूबिंग और bioreactor जुड़े सिस्टम ऊपर दिखाया गया है L/S18 टयूबिंग एक Masterflex पंप द्वारा पंप किया जाएगा और इस तरह प्रवाह ड्राइविंग.. दबाव transducer ऊपरी धारा में bioreactor में प्रवेश करने से पहले दबाव उपाय करेंगे.
चित्रा 5. काटा इंजीनियर पोत की छवि इंजीनियर वाहिकाओं अपारदर्शी होना दिखाई देते हैं और काँपने के गुणवाला शर्तों के तहत 8 सप्ताह की संस्कृति के बाद लगभग 250μm की एक दीवार मोटाई को प्राप्त होगा.
चित्रा 6. Haematoxylin और Eosin दाग इंजीनियर वाहिकाओं के पार वर्गों ए और बी 8 सप्ताह के गैर - स्पंदित और स्पंदित वाहिकाओं, क्रमशः रहे हैं.सी और डी के 4 सप्ताह गैर स्पंदित और स्पंदित वाहिकाओं, क्रमशः रहे हैं. एल जहाजों की luminal ओर इंगित करता है. तराजू बार 100μm है.
7 चित्रा. कोलेजन के लिए Masson Trichrome दाग (नीला) इंजीनियर वाहिकाओं के पार वर्गों के लिए ए और बी 8 सप्ताह के गैर - स्पंदित और स्पंदित वाहिकाओं, क्रमशः रहे हैं . सी और डी के 4 सप्ताह गैर स्पंदित और स्पंदित वाहिकाओं, क्रमशः रहे हैं. ध्यान दें कि 4 सप्ताह स्पंदित पोत अपने गैर स्पंदित समकक्ष से अधिक कोलेजन से पता चलता है है. व्हाइट तीर वाहिकाओं में पीजीए टुकड़े शेष करने के लिए बिंदु. तराजू बार 100μm है.
8 चित्रा. गोजातीय इंजीनियर धमनियों में एसएमसी मार्करों के Immunochemistry धुंधला हो जाना. चिकना मांसपेशियों α-actin, calponin-1, और चिकनी पेशी मायोसिन भारी चेन (SMMHC) जल्दी, मध्यवर्ती, और देर एसएमसी सिकुड़ा मार्करों, क्रमशः रहे हैं . 12 सप्ताह की संस्कृति के अंत तक, बर्तन में कोशिकाओं दीवार व्यक्त α-actin एस.एम. और Calponin-1 और SMMHC के मध्यम मात्रा में. तराजू बार 20μm है.
| घटक | मात्रा |
| DMEM (संशोधित / DME कम) | 500 मिलीलीटर |
| FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम) गर्मी निष्क्रिय | 100 मिलीलीटर |
| HEPES 1.0 M | 5ml |
| विटामिन सी (पीबीएस या DMEM में भंग) | 25 मिलीग्राम |
| Proline / / Glycine Alanine 25 mg/25 mg/10 मिलीग्राम (पीबीएस के 5ml में भंग) | 5ml |
| CuSO 4 1.5 μg (पीबीएस के in1 मिलीलीटर भंग) | 1ml |
| 10,000 इकाइयों में पेनिसिलीन जी / मिली | 5ml |
| 10ng/ml PDGF-बी बी (प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक - बी बी) | 5μg |
| 10ng/ml पर bFGF (बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक) | 5μg |
तालिका 1. "4-10" मध्यम के घटक उपरोक्त तालिका में दिखाए जाते हैं PDGF-बी बी और bFGF के अपवाद के साथ, सभी अन्य घटकों 0.2μm पूर्व फिल्टर का उपयोग करने के लिए के माध्यम से फ़िल्टर्ड किया जाना है.
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Discussion
इंजीनियर वाहिकाओं की गुणवत्ता के बड़े भाग में टिशू कल्चर में इस्तेमाल किया SMCs की गुणवत्ता से तय है. एसएमसी phenotype के महत्वपूर्ण पहलुओं सिकुड़ा आकारिकी, कम बीतने संख्या, और bioreactor अंदर पैदा करने की क्षमता शामिल है. हम अनुशंसा करते हैं कि बीतने संख्या सेल बोने के समय पर नहीं पी 3 से अधिक बहुलक पाड़ पर. इसके अलावा, यह पुष्टि करते हैं कि एसएमसी स्रोतों mycoplasma मुक्त पहले कर रहे हैं उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. हमने देखा है कि mycoplasma दूषित कोशिकाओं सेलुलर और bioreactor संस्कृति में मैट्रिक्स कोलेजन बयान प्रसार में काफी घट जाती है के लिए नेतृत्व.
से अधिक 400.000 कोरोनरी धमनी grafts बाइपास ऑपरेशन के लिए प्रत्येक वर्ष की जरूरत है, छोटे व्यास grafts (<6mm) नाड़ी 12 के लिए एक उच्च मांग में जिसके परिणामस्वरूप. अंतिम लक्ष्य कार्यात्मक छोटे व्यास वाहिकाओं है कि देशी ऊतक के शारीरिक कार्यों की नकल इंजीनियर है. हमारी काँपने के गुणवाला bioreactor प्रणाली कार्यात्मक धमनी grafts है कि बहाल करने और रोगग्रस्त धमनियों को जगह ले सकता है गठन करने के लिए एक आशाजनक मतलब है. एक रासायनिक और यंत्रवत् नियंत्रित वातावरण में, bioreactor हमें सक्षम बनाता है implantable छोटे व्यास वाहिकाओं है कि एक्ज़िबिट मजबूत सीवन प्रतिधारण और उत्कृष्ट यांत्रिक गुणों इंजीनियर है. काँपने के गुणवाला bioreactor प्रणाली के विभिन्न आकार और आयामों में गोजातीय 3, 6,7, सुअर और मानव कोशिकाओं 9 से धमनियों, पुनर्निर्माण इस प्रकार इस प्रणाली generalizable और बहुमुखी बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, हम हमारे bioreactor संवहनी बाह्य मैट्रिक्स, गैर invasively 8 के वास्तविक समय इमेजिंग की अनुमति संशोधित किया है . हमारे bioreactor, गैर इनवेसिव माइक्रोस्कोपी इमेजिंग तकनीक, और उन्नत biomechanical आकलन का एक संयुक्त दृष्टिकोण की मदद से हमें यह समझने में और अधिक समय संवहनी यांत्रिक गुणों में ECM बयान और परिवर्तन का मूल्यांकन होगा.
इसलिए, इस bioreactor प्रणाली एक अद्वितीय दृष्टिकोण के लिए जैविक आधारित संवहनी grafts इंजीनियर है, जो ऑटोलॉगस संवहनी grafts के उत्थान में भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों 10,11 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं प्रदान करता है .
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम स्वास्थ्य अनुदान EB-R01 ०,०८,८३६ के राष्ट्रीय संस्थानों और HL083895 R01 द्वारा वित्त पोषित है (दोनों और LEN के लिए). हम हमारे शोध के लिए बायोरिएक्टर बनाने के लिए, विश्वविद्यालय कंचेरा, डेरिल स्मिथ का शुक्रिया अदा करना सकता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS (Fetal Bovine Serum) Heat-Inactivated | Hyclone | SH30071 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| rhFGF-basic | R&D Systems | 234-FSE | |
| rrPDGF-BB | R&D Systems | 520-BB | |
| Penicilin G | Sigma-Aldrich | PENNA | |
| Copper(II) Sulfate | Sigma-Aldrich | C8027 | |
| Gylcine | Sigma-Aldrich | C8790 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-25G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Silicone Stopper | Cole-Parmer | 06298-24 | |
| Masterflex tubes L/S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 | |
| Masterflex pump | Cole-Parmer | 7553-80 | |
| Dacron cuff | Maquet | 174406 | |
| PGA felt | Concordia | MO000877-01 | |
| 4-0 1.5 metric Surgipro II suture | Syneture | VP-557-X | |
| 6-0 0.7 metric Dexon suture | Syneture | 7538-11 | |
| 0.22μm PTFE filters | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
| Three Way Stop-cock | Edwards Lifesciences | 593WSC | |
| Pressure Transducer | Edwards Lifesciences | PX212 | |
| IV bags | Baxter Internationl Inc. | R4R2110 | |
| Saline dilution set | Arrow International | W20030 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain | F05027 |
References
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