Summary
우리 그룹은 심장 혈관 시스템의 생리 타악기의 스트레스가 implantable 작은 직경 혈관 이식을 다시 생성하기 위해 일일 생물 반응기 문화 시스템을 개발했습니다.
Abstract
많은 노력이 기능 작은 지름 동맥은 무시 재생하는 방법을 개발하고 발전하는데 최선을 다해오고 있습니다. 생리적 환경에서 모두 기계적 및 화학적 자극은 동맥 혈관의 1,2의 적절한 개발 및 기능을 유지하기 위해 필요합니다.
우리의 그룹에 의해 개발된 생물 반응기 문화 시스템은 기본 선박의을 흉내낸 정확하게 제어 화학 기계 환경에서 혈관 재생을 지원하기 위해 설계되었습니다. 우리의 생물 반응기 조립 및 유지 보수 절차는 매우 간단하고 3,4 매우 반복됩니다. 평활근 세포 (SMCs)는 호환 실리콘 튜브를 통해 스레드 및 최대 12 주 동안이나 타악기 자극없이 생물 반응기에서 교양있는 관형 polyglycolic의 산성 (PGA) 메쉬에 씨앗을 품고있다. 일부 이전부터 우리의 생물 반응기를 구분 네 가지 주요 속성이 있습니다. 1) 전용 원시 혈관의 주변 생화학을 시뮬레이트 다른 문화 시스템과는 달리, 우리의 생물 반응기는 또한 문화의 혈관에 순환 방사상 변형을 적용하여 생리 타악기 환경을 만듭니다. 2) 여러 설계 선박은 제어 화학 환경에서 다른 기계 조건 하에서 동시에 교양 수 있습니다. 3) 생물 반응기 쉽게 동물 주입 모델에 대한 설계 선박의 luminal쪽으로 코팅하는 내피 세포의 모노 레이어 (EC)를 수 있습니다. 4) 우리의 생물 반응기는 또한 서로 다른 직경의 크기와 문화 엔지니어링 선박은 특정 직경 크기에 맞게 각 생물 반응기에 맞는 노력을 절약 1mm에서 3mm로 원거리 수 있습니다.
우리의 생물 반응기에서 교양 설계 선박 어느 정도 histologically 원시 혈관을 닮은. 용기 벽의 세포는 평활근 마이 오신 중쇄 (SMMHC) 3 성숙 SMC 수축성 마커를 표현한다. 콜라겐의 상당한 금액이 설계 선박 5 최고의 기계적 강도에 대한 책임있는 세포외 기질 내에 입금됩니다. 생화 학적 분석은 또한 엔지니어링 선박의 콜라겐 함량이 기본 동맥 6에 필적 나타냅니다. 중요한 것은, 타악기 생물 반응기는 지속적으로 동물 모델 3,7 성공적으로 주입 실험을 허용 기계적 성질을 전시 혈관을 재생하고 있습니다. 또한이 생물 반응기는 더욱 비선형 광학 현미경 (NLOM) 8을 사용하여 시간이 지남에 따라 콜라겐 리모델링의 실시간 평가 및 추적, 비 invasively를 허용하도록 수정할 수 있습니다. 결론이 생물 반응기는 기능성 작은 직경 이식 혈관의 재생을 조절 기본 메커니즘을 연구하는 훌륭한 플랫폼 역할을한다.
Protocol
압력솥
흐름 시스템 및 그림 1과 그림 2에 지시 생물 반응기 구성 요소 (생물 반응기 자체와 실리콘 마개 덮개)의 튜브를 조립하고 압력솥. 튜브를 수유하면 한쪽에있는 커넥터와 반대쪽에 열린 최종 수 있습니다. 세 짧은 튜브 세그먼트는 가스 교환을위한 실리콘 마개를 통해 삽입됩니다.
1. 재봉 PGA 메쉬
- 컷 PGA 메쉬 1.1cm로 X ~ 8cm 시트 (생물 반응기의 크기에 따라 다름).
- 증류수 (dH20)와 사용하기 전에 건조 공기와 깨끗한 실리콘 튜브 (3mm 내경).
- 하나의 바늘로 추종하는자가 세 수술 노트로 시작하는 깨끗한 실리콘 튜브 주위 PGA 메쉬를 바느질 Dexon 6.0 치료를 사용합니다.
2. PGA는 표면 처리를 공사장 공중 발판
- 1 - 2min과 치료 시간을 기록하고 모든 PGA 공사장 공중 발판에 대해 같은 시간을 사용 1M NaOH의 수영 PGA 공사장 공중 발판.
- 이분 3 회 대한 dH2O 욕조에서 PGA 공사장 공중 발판을 씻어.
- 팻 PGA는 DH 2 O 욕조의 각 수영 사이 Kimwipes와 건조 공사장 공중 발판.
- 조직 문화 후드 아래에 드라이 PGA는 공사장 공중 발판 송풍기와 함께 15 분 동안 건조 공기.
3. 재봉 Dacron의 무기
- 2~3밀리미터의 오버랩으로 PGA 메쉬의 각 엔드에 Dacron 손목에 수갑을 (1cm)의 작은 조각을 바느질 Prolene 4.0 치료를 사용합니다. 참고 :주의하지 찔린 실리콘 튜브 (그림 3).
- Dacron과 손목에 수갑의 무료 결국 주변에 3 개의 실밥을 바느질로 동일한 치료를 사용합니다. 5.1 단계 (그림 3) Prolene 봉합사의 자유로운 끝에 충분한 봉합을 떠날 있는지 확인하십시오.
4. 생물 반응기의 어셈블리 (생물 반응기 문화의 시작 전날)
- 20-30분의 70 % 에탄올 욕조에 수놓은 메쉬와 실리콘 튜브, 수술 도구, 그리고 얇은 철사를 만끽해보세요.
- 사전 조립 최소한 30 분간 70 % 에탄올 욕조에서 생물 반응기 및 잠수함을 포함하고있는 압력솥 파우치를 엽니다. 에탄올과 함께 철저하게 생물 반응기를 플러시해야합니다. 70 % 에탄올에 대한 모든 생물 반응기 구성 요소의 노출은 또한 살균 단계입니다. 이 단계는 또한 autoclaving에 의해 제거하고 혈관 세포에 해로운이 아닌 내독소를 제거합니다.
- 그것을 이겨 내길 얇은 와이어를 사용하여 측면 무기를 통해 실리콘 튜브를 당겨.
- (에탄올에 빠져들 메쉬를 유지) 에탄올 욕조 밖으로 생물 반응기를 가져가라. 긴축과 Prolene의 봉합 (그림 3)을 아래로 묶은하여 flared 유리 입술을 통해 Dacron과 손목에 수갑을 체결하여 생물 반응기 내부의 PGA 발판을 수정.
- 실리콘 튜브를 통해 커넥터 생물 반응기 사이드 팔 한쪽을 연결합니다.
- 충분한 긴장과 실리콘 튜브의 다른 측면을 끌어 오기 및 실리콘 튜브에 남아있는 두 커넥터를 삽입합니다. 커넥터를 삽입하면 단단히 실리콘 튜브에 잡아!
- 꽂아의 에탄올 욕조에 생물 반응기와 부드럽게 측면 무기의 커넥터를 철수하여 에탄올을 잔뜩.
- 생물 반응기 뒤집어하고 10 분 동안 흠뻑 젖어 수 있습니다.
- 뒤집기 생물 반응기는 오른쪽 위, 추가 10 분 만끽해보세요.
- 모든 에탄올 드레인.
- 초과 에탄올은 튜브의 끝부분에서 병뚜껑 틈에다 떨어뜨린 저장할 센터 접시에 시리즈 및 장소 생물 반응기에서 3 대 배양 접시 (10 ㎝)을 설정합니다.
- 5ml 또는 10ml의 피펫을 사용하여 조직 문화 물로 생물 반응기와 PGA 메쉬를 플러시. 실리콘 튜브로 또한 플러시 조직 문화 물.
- 철저하게 생물 반응기의 양쪽에 배양 접시에 모든 여분의 물을 배수.
- 에 송풍기 및 자외선 OFF로 후드에서 하룻밤 건조 생물 반응기.
- 추가 참고 : 살균 저어 표시줄이 생물 반응기에 있는지 확인하십시오. ,이 시점에서 생물 반응기를 통해 "가져가"로 오염을 방지하지 않도록하십시오. 많은 parafilm 스트립의를 잘라 작은 70 % 에탄올 목욕 (대형 페트리 접시가 잘 작동)에서 그들을 만끽해보세요.
5. 1 일 : 생물 반응기 설정
- 오염 물질의 PGA 비계 내부를 보호하기 위해 각 생물 반응기의 개방을 통해 멸균 배양 접시를 놓습니다.
- 그림 4와 parafilm 모든 연결 관절에 표시된로 생물 반응기에 흐름 시스템을 조립.
- 알코올 잎사귀와 첫번째 커넥터를 닦아주십시오.
- 생물 반응기의 세 번째 미사용 팔에 주사 포트를 연결합니다.
- 해마의 튜브를 제거하고 가능한 Y - 접합에 가까운 호수로 설정 희석의 푸른 끝을 묶을. 튜브의이 부분에 어떤 액체 전달을 보장하지 곳에서 튜브 클램프를 당겨
- IV 가방 제거 및 IV 가방의 먼 끝에 바다 코끼리 튜브 (적색)을 연결합니다. 첫번째 알코올로 닦아 삽입 포트를 닦아 있는지 확인하십시오.
- (화이트 엔드 튜브를 통해) 플로우 시스템의 한쪽으로 해마를 연결합니다.
- 플로우 시스템에 3 방향 꼭지를 삽입합니다.
- 압력 변환기를 제거 및 세 방향 꼭지에 연결합니다.
- 가방에 중간 개방에 압력 변환기의 다른 쪽 끝을 연결합니다.
- 연결Y - 접합을 통해 흐름을 시스템에 생물 반응기. IV 가방에 350ml 1 %의 fungizone (PBS의 495ml와 함께 믹스 5ml의 fungizone)을 추가 60ml 주사기를 사용하십시오.
- PBS의 흐름을 허용하도록 중지 자지를 조정하여 흐르는 시스템을 플러시 IV 가방 머리를 묶어라. 참고 :이 유출되도록하지 생물 반응기 내부 확인합니다.
- 각 PGA scafffold에 매체와 씨앗의 1.25ml 8 X10 6 SMCs를 (약 합류 T75) 다시 일시 중지합니다. 세포 현탁액이 균일하게 PGA 메쉬의 하단쪽으로뿐만 아니라 프로 골프 (PGA) 메쉬 - Dacron 접합에 병뚜껑 틈에다 떨어뜨린되어 있는지 확인하십시오.
- 알코올로 생물 반응기의 RIM이 옆으로 선회 방지 생물 반응기를 회전을 통해 닦아 닦아주십시오.
- 실리콘 스토퍼 뚜껑 조립 (그림 2)
- 다시 신중하게 압력솥 가방 껍질, 덮개의 바닥을 노출하지 않도록하고.
- 남성 커넥터에서 수유 관에 주입 포트를 연결합니다.
- 세 공기 포트 각 PTFE 0.20 μm의 필터를 부착합니다.
- 이 과정에서 노출 / 덮개의 아래쪽을 만지지 않도록주의하십시오.
- Parafilm 사출 포트.
- 유리 생물 반응기에 실리콘 마개 덮개를 삽입하고 생물 반응기 내부의 공급 튜브가 씨앗 PGA의 공사장 공중 발판을 만지지 있지 않은지 확인하십시오. 뚜껑 주위 Parafilm.
- 인큐베이터 안에 흐름 시스템 (옆에 있습니다)와 생물 반응기를 삽입하여 생물 반응기에게 25-30분위한 5 분마다 회전.
- 로 설명의 4-10 문화 미디어의 400ml (표 1) 생물 반응기 챔버를 입력합니다. 이 배지는 돼지의 설계 동맥의 "최적화"입니다.
6. 일 6-7 : 펌프 켜기하고, 첫 수유
- 6-7일에 대한 실리콘 튜브를 통해 펌핑 어떤 타악기없이 정적 씨앗 공사장 공중 발판을 성장. 이 기간 동안 중간 변경하거나 비타민 C의 보완에 대한 필요가 없습니다.
- 펌프를 켜기 전에 PBS 또는 유동 시스템 튜브의 꼬임에 대한 누수가 없는지 확인합니다.
- 흐름 시스템의 펌프의 전원을 켜고 압력이 약 270/-30mmHg 읽는 있도록 펌프 설정을 조정할 수 있는지 확인하십시오.
- 기록 문화 전반에 걸쳐 매일 압력 및 270/-30mmHg에서 압력을 유지합니다. 압력 변환기는 압력을 읽고 모니터를 컴퓨터에 연결할 수 있습니다.
첫 수유
- 매체 변화와 중소 폐기물 deposal 목적으로 모두 피부를 먹이로 사출 포트 & PTFE 필터를 조립.
- 단단히 펌프에 공급 튜브를 삽입하고 생물 반응기와 먹이 뚜껑에 다른 쪽 끝을의 포트를 공급하는 한쪽 끝을 삽입합니다. 에탄올 잎사귀와 함께 사출 포트를 닦아 있는지 확인하십시오.
- 매체의 200ml를 펌프로 듀얼 방향 Masterflex 펌프를 사용합니다. 다음 생물 반응기에 다시 신선한 매체의 200ml를 펌프에 새로운 먹이 튜브를 사용합니다. 생물 반응기 중간을 다시 펌프 특히 항상 아주 느린 속도로 시작합니다.
- 중간 및 보완의 아스코르비 산의 2x/week을 변경합니다. 아스코르비 산을 추가하려면, 매체 25ml를 가지고 조직 후드에 따로 배치 30ml 주사기를 사용합니다. PBS의 5ml에 아스코르비 산의 25mg을 디졸브 및 필터 0.22 μm의를 통해 필터링합니다. 먼저 이송 관에 멸균 아스코르비 산을 주사 및 이전 버전 제거 25ml 매체를 다시 추가합니다. 중간 제조법은 표 1에 있습니다.
7. 대표 결과 :
그림 1. 흐름 시스템 조립 튜브 및 커넥터가 위에 표시됩니다.
그림 2. 실리콘 스토퍼 덮개 어셈블리 위에 표시됩니다.
그림 3. 생물 반응기 조립의 설계도가 위에 표시됩니다. 생물 반응기의 Dacron과 손목에 수갑이 푸른 봉합의 옹이와 유리 무기에 고정 아르 인사이드.
그림 4. 관 그리고 생물 반응기에 연결된 흐름 시스템은 위에 표시됩니다. L/S18 튜브가 Masterflex 펌프에 의해 펌핑하기 때문에 흐름을 운전한다. 압력 변환기는 상류에있는 생물 반응기를 입력하기 전에 압력을 측정합니다.
그림 5. 수확 공학 선박의 이미지. 엔지니어링된 선박 불투명으로 표시하고 타악기 조건 8 주 문화 후 약 250μm의 벽 두께를 얻을 수 있습니다.
그림 6. 공학 선박의 Haematoxylin과 Eosin 스테인드 상호 섹션. A와 B는 각각 선박 8 주 비 펄스와 펄스 수 있습니다.C와 D는 각각 4 주간 아닌 펄스와 펄스 선박입니다. L은 혈관의 luminal 측면을 나타냅니다. 저울 막대가 100μm이다.
그림 7. 공학 선박의 크로스 섹션에 대한 콜라겐에 대한 메이슨의 Trichrome 얼룩 (청색). A와 B는 각각 8 주 비 펄스와 펄스 선박입니다. C와 D는 각각 4 주간 아닌 펄스와 펄스 선박입니다. 4 주간의 펄스 선박는 아닌 펄스 대응보다 더 많은 콜라겐을 표시합니다. 화이트 화살표는 혈관에 PGA의 조각을 나머지를 가리 킵니다. 저울 막대가 100μm이다.
그림 8. 보빈 설계 동맥의 SMC 마커 Immunochemistry의 얼룩이. 평활근 α - 굴지, calponin - 1, 평활근 마이 오신 중쇄 (SMMHC)는 각각 초기, 중간, 그리고 늦은 SMC 수축성 마커입니다. 12 주 문화의 마지막으로, 선박의 세포 벽 표현 SM α - 굴지 및 Calponin - 1 SMMHC의 중간 정도입니다. 저울 막대가 20μm이다.
| 구성 요소 | 양 |
| DMEM (DME / 낮은 수정) | 500 ML |
| FBS (태아 소 혈청) 열 inactivated | 100 ML |
| HEPES 1.0 M | 5ml |
| 비타민 C (PBS 또는 DMEM에 용해) | 25 MG |
| 프롤린 / 글리신 / 알라닌 25 mg/25 mg/10 MG (PBS의 5ml에 용해) | 5ml |
| CuSO 4 1.5 μg (PBS의 in1 ML을 해산) | 1ml |
| 페니실린 만 단위에서 G / ML | 5ml |
| 10ng/ml에서 PDGF - BB (혈소판 - 유래 성장 인자 - BB) | 5μg |
| 10ng/ml에서 bFGF (기본 fibroblast의 성장 인자) | 5μg |
표 1. "40-10"매체의 구성 요소는 위의 테이블에 표시됩니다. PDGF - BB와 bFGF를 제외하고 다른 모든 구성 요소를 사용하기 전에 0.2μm 필터를 통해 필터링하는 것입니다.
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Discussion
공학 선박의 품질은 조직 문화에서 사용 SMCs의 품질에 의해 결정 큰 부분이다. SMC 표현형의 중요한 측면은 수축성 형태, 낮은 통로 번호 및 생물 반응기 내부의 세포 분열 따위에 의해 번식하는 능력이 포함됩니다. 우리는 통로 번호 폴리머 비계에 세포 시딩 시에 P3보다 크지 않아야하는 것이 좋습니다. 또한, 그것은 SMC 소스를 사용하기 전에 mycoplasma 무료 있는지 확인하기 위해 중요합니다. 우리는 mycoplasma - 오염된 세포 생물 반응기의 문화에 세포 증식 및 콜라겐 매트릭스 증착의 실질적인 감소로 이어질 것을 관찰했습니다.
이상 400,000 관상 동맥 이식은 작은 직경 (<6mm) 혈관 이식 12 수요의 결과로, 매년 바이패스 작업에 필요합니다. 궁극적인 목표는 기본 조직의 생리 기능을 모방 기능성 소형 직경 혈관 엔지니어입니다. 우리의 타악기 생물 반응기 시스템은 병에 걸린 동맥을 복원하고 대체할 수있는 기능 동맥 이식을 구성하는 유망 의미입니다. 화학적 및 기계적 제어 환경에서 생물 반응기는 강력한 봉합 유지하고 우수한 기계적 성질을 전시 implantable 소형 직경 혈관 엔지니어 우리에게 있습니다. 타악기 생물 반응기 시스템은 따라서이 시스템 generalizable 및 다용도 만들기, 다양한 크기 및 차원에 소 3, 돼지의 6,7, 그리고 인간의 세포 9 동맥을 재구성하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 우리는 혈관 세포 매트릭스, 비 invasively 8 실시간 영상을 허용하기 위해 생물 반응기를 수정했습니다. 우리의 생물 반응기, 비침습 현미경 이미징 기술, 고급 biomechanical 평가 통합 접근 방식은 우리가 시간이 지남에 혈관 기계적 성질에 ECM 증착 및 변경 사항을 이해하고 평가하는 데 도움이 될 것입니다.
따라서이 생물 반응기 시스템은 미래의 임상 응용 10,11에서 autologous 이식 혈관 재생에 중요한 역할을 수 있습니다 생물학 기반의 혈관 이식을 엔지니어에 대한 독특한 접근 방식을 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 (LEN 양쪽) 국민 건강 그랜트 R01 EB - 008836의 연구소와 R01 HL083895으로 후원됩니다. 우리는 우리의 연구 bioreactors을 만들기위한 다릴 스미스 대학의 유리를 불어 만드는 직공을 감사 드리고 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS (Fetal Bovine Serum) Heat-Inactivated | Hyclone | SH30071 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| rhFGF-basic | R&D Systems | 234-FSE | |
| rrPDGF-BB | R&D Systems | 520-BB | |
| Penicilin G | Sigma-Aldrich | PENNA | |
| Copper(II) Sulfate | Sigma-Aldrich | C8027 | |
| Gylcine | Sigma-Aldrich | C8790 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-25G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Silicone Stopper | Cole-Parmer | 06298-24 | |
| Masterflex tubes L/S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 | |
| Masterflex pump | Cole-Parmer | 7553-80 | |
| Dacron cuff | Maquet | 174406 | |
| PGA felt | Concordia | MO000877-01 | |
| 4-0 1.5 metric Surgipro II suture | Syneture | VP-557-X | |
| 6-0 0.7 metric Dexon suture | Syneture | 7538-11 | |
| 0.22μm PTFE filters | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
| Three Way Stop-cock | Edwards Lifesciences | 593WSC | |
| Pressure Transducer | Edwards Lifesciences | PX212 | |
| IV bags | Baxter Internationl Inc. | R4R2110 | |
| Saline dilution set | Arrow International | W20030 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain | F05027 |
References
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