Summary
Vår grupp har utvecklat ett system bioreaktor kultur som efterliknar fysiologiska pulserande betonar av det kardiovaskulära systemet för att regenerera implanterbara liten diameter vaskulära ympkvistar.
Abstract
Mycket arbete har ägnats åt att utveckla och främja metoder för att återskapa funktionella liten diameter arteriella förbi. I den fysiologiska miljön är både mekanisk och kemisk stimulering krävs för att upprätthålla en god utveckling och funktion av arteriell fartyg 1,2.
Bioreaktor kultur system som utvecklats av vår grupp är avsedda att stödja fartyget förnyelse inom en exakt kontrollerad kemo-mekaniska miljön imiterar att inhemska fartyg. Vår bioreaktor montering och underhåll är ganska enkel och hög repeterbarhet 3,4. Glatta muskelceller (SMC) är seedade på en tubulär polyglycolic syra (PGA) nät som träs över kompatibel silikonslang och odlas i bioreaktor med eller utan pulserande stimulans i upp till 12 veckor. Det finns fyra huvudsakliga attribut som skiljer våra bioreaktor från några föregångare. 1) Till skillnad från andra kultur-system som simulerar bara den biokemiska omgivande inhemska blodkärl, skapar vår bioreaktor också ett fysiologiskt pulserande miljö genom att cykliska radiell belastning på fartyg i kulturen. 2) Flera tillverkade fartyg kan odlas samtidigt under olika mekaniska förhållanden i en kontrollerad kemisk miljö. 3) Den bioreaktor tillåter en mono lagret av endotelceller (EG) lätt kan appliceras på de luminala sidan av konstruerade fartyg för djurmodeller implantation. 4) Vår bioreaktor kan också kulturen konstruerad fartyg med olika diameter storlek varierade från 1 mm till 3 mm, vilket sparar arbetet med att skräddarsy varje enskild bioreaktor för att passa en viss diameter storlek.
De tekniska fartyg odlade i våra bioreaktor liknar infödda blodkärl histologiskt till viss del. Celler i kärlväggen uttrycka mogna SMC kontraktila markörer som glatt muskulatur myosin heavy chain (SMMHC) 3. En betydande del av kollagen deponeras inom det extracellulära matrix, som ansvarar för ultimat mekanisk hållfasthet konstruerad fartyg 5. Biokemiska analys indikerar också att kollagenhalten av konstruerade fartyg är jämförbar med infödda artärer 6. Viktigare är att pulserande bioreaktor regenererade konsekvent fartyg som uppvisar mekaniska egenskaper som medger lyckad implantation experiment i djurmodeller 3,7. Dessutom kan detta bioreaktor ändras ytterligare för att i realtid utvärdering och uppföljning av kollagen remodeling över tid, icke-invasivt, med hjälp av en icke-linjär optisk mikroskopi (NLOM) 8. Avslutningsvis bör detta bioreaktor fungera som en utmärkt plattform för att studera de grundläggande mekanismerna som reglerar förnyelse av funktionella liten diameter vaskulära ympkvistar.
Protocol
Autoklav
Montera och autoklav slangen för flödet system och komponenter bioreaktor (bioreaktor själv och silikon proppen locket) enligt anvisningarna i figur 1 och figur 2. Inmatningsrör har en hankontakt i ena änden och en öppen ände på andra sidan. Tre korta slangar segment in genom ett silikon cap för gas utbyte.
1. Sömnad PGA Mesh
- Klipp PGA nät till 1.1cm x ~ 8cm blad (beroende på bioreaktor storlek).
- Rengör silikonslang (3mm innerdiameter) med destillerat vatten (dH20) och lufttorka före användning.
- Använd Dexon 6,0 sutur att sy PGA mesh runt rent silikonslang som börjar med tre kirurgiska knutar följt av enstaka stygn.
2. PGA Ställningar Ytbehandling
- Doppa PGA ställningar i 1M NaOH för 1-2min och registrera behandlingstiden och använder samma tid för alla PGA ställningar.
- Skölj PGA ställningar i dH2O bad för 2 minuter 3 gånger.
- Pat PGA ställningar torr med Kimwipes mellan varje dopp i dH 2 O bad.
- Torr PGA ställningar i vävnadskultur huven lufttorka i 15 minuter med fläkten.
3. Sömnad Dacron armar
- Använd Prolene 4,0 sutur för att sy små bitar av Dacron manschetter (1 cm) på vardera änden av PGA mesh med ett överlapp av 2-3mm. Obs: Var noga med att inte punktera silikonslang (Figur 3).
- Använd samma suturen att sy tre stygn runt fria ände Dacron manschetter. Se till att lämna tillräckligt suturer på den fria ändarna av Prolene sutur för steg 5,1 (Figur 3).
4. Montering av Bioreaktor (dagen före början av bioreaktor kultur)
- Blötlägg sydda mesh och silikonslang, kirurgiska instrument, och en tunn tråd i en 70% etanol badet i 20-30 minuter.
- Öppna autoklaven påsarna innehåller bioreaktor och dränka den i 70% etanol bad i minst 30 minuter före montering. Se till att spola bioreaktor noggrant med etanol. Exponering av alla bioreaktor komponenter till 70% etanol är ett tillägg sterilisering steg. Detta steg tar även bort endotoxin, som inte avlägsnas genom autoklavering och är skadliga för vaskulära celler.
- Dra silikonslang genom sido-armarna med hjälp av tunn tråd att dra igenom det.
- Ta bioreaktor av etanol badet (håll mesh dränkta i etanol). Fäst PGA schavotten inne i bioreaktor genom att fästa Dacron muddar över utsvängda glas läppar genom att dra åt och binda ner Prolene suturer (Figur 3).
- Anslut ena sidan av vapen bioreaktor sida till kontakter via silikonslangar.
- Dra andra sidan av silikonslang tillräckligt med spänning och sätt in de återstående två kontakterna i silikonslangar. Håll i silikonslang hårt när du sätter i kontakterna!
- Sätt bioreaktor till etanol badet och skölj med etanol genom att dra kontakterna ut från sidan armar.
- Vänd bioreaktor över och ge en blöt i 10 minuter.
- Flip bioreaktor höger sida upp och dra i ytterligare 10 minuter.
- Töm ut all etanol.
- Sätt upp tre stora petriskålar (10 cm) i serie och placera bioreaktor i mitten skålen för att hålla överskottet etanol droppade från ändarna av rören.
- Skölj bioreaktor och PGA mesh med vävnadsodling vatten med en 5 ml eller 10 ml pipett. Även spola vävnadskultur vatten i silikonslangar.
- Grundligt dränera ut allt vatten i petriskålar på vardera sidan av bioreaktor.
- Torr bioreaktor över natten i huva med fläkt på och UV-OFF.
- Ytterligare anmärkningar: se till sterila rör bar i bioreaktor. Se till att inte "sväva" över bioreaktor från denna punkt framåt, för att undvika kontaminering. Skär upp massor av parafilm remsor och blöta dem i en liten 70% etanol bad (stor petriskål fungerar bra).
5. Dag 1: Bioreaktor Setup
- Placera en steril petriskål över öppnandet av varje bioreaktor för att skydda PGA schavotten insidan från föroreningar.
- Montera flödessystem till bioreaktor som visas i figur 4 och parafilm alla anslutningen leder.
- Torka kontakterna först med spritkompresser.
- Fäst injektionsport till tredje, oanvända arm bioreaktor.
- Ta bort valross slang och fästa blå delen av saltlösning utspädning sättas så nära Y-korsning som möjligt. Dra slanghållare för att säkerställa ingen vätska överföring till denna del av röret
- Ta bort infusionspåse, och bifoga valross slang (röd) till bortre änden av IV väska. Se till att torka insättning port med alkohol torka först.
- Fäst valross vid sidan av flödet systemet (via vit slutet rör).
- Sätt in 3-vägs kran i flödessystem.
- Ta bort tryckgivare och ansluta till trevägskran.
- Fäst andra änden av tryckgivare till mitten öppning i väskan.
- Anslutbioreaktorn till flödet systemet via Y-korsning. Använd en 60 ml spruta för att lägga till 350 ml 1% fungizone (blanda 5ml fungizone med 495ml PBS) till IV påse.
- Pressa IV påse att spola flyter systemet genom att justera stop kukar att tillåta flöde av PBS. Obs: Kontrollera insidan bioreaktor att säkerställa att det inte finns något läckage.
- Återsuspendera 8 x10 6 SMC (cirka en konfluenta T75) i 1,25 ml av medium och utsäde på varje PGA scafffold. Se cellsuspension jämnt har droppat in på PGA mesh-Dacron korsningen samt på undersidan av PGA mesh.
- Torka kanten av bioreaktor med spritkompress via vrida bioreaktor sidled undvika svävar.
- Silikon propp lock församling (figur 2)
- Skala autoklaveringspåse tillbaka försiktigt, se till att inte utsätta botten av locket.
- Fäst injektion port inmatningsrör på den manliga kontakten.
- Fäst PTFE 0,20 ìm filter för att var och en av de tre flygplatserna.
- Var noga med att inte utsätta / röra botten av locket under denna process.
- Parafilm injektionen porten.
- Sätt på locket silikon propp i glas bioreaktorn och se till att sond inuti bioreaktor inte vidrör seedade PGA ställningar. Parafilm runt locket.
- Placera bioreaktor med flödet systemet inne i inkubatorn (på sidan) och vrid bioreaktor var 5 minuter i 25-30 minuter.
- Fyll bioreaktor kammaren med 400ml av vår 4-10 kultur media som beskrivs i (tabell 1). Denna kultur medium "optimeras" för svin konstruerad artärer.
6. Dag 6-7: Slå på pumpen, och första Feeding
- Växa seedade byggnadsställningar statiskt utan pulserande pumpning genom silikonslang för 6-7 dagar. Det finns ingen anledning för medelstora ändra eller C-vitamin tillskott under denna tid.
- Se till att det inte finns några läckor av PBS eller böjs av flödessystem slangen innan du slår på pumpen.
- Slå på pumpen i flödet systemet och se till att justera pumpen inställning så att trycket läser cirka 270/-30mmHg.
- Spela tryck dagligen under kultur och bibehålla trycket på 270/-30mmHg. Tryckgivare kan anslutas till en dator för att läsa och kontrollera trycket.
Första Utfodring
- Montera injektionsport & PTFE filter på utfodring lock för både medelstora förändring och medelstora avfall deposal ändamål.
- Placera sond ordentligt på pumpen och sätt in ena änden till utfodring hamn i bioreaktor och den andra änden till utfodring locket. Se till att torka av injektionsstället portarna med etanol våtservetter.
- Använd en dubbel riktningar Masterflex pump för att pumpa ut 200 ml medium. Använd sedan en ny sond för att pumpa 200 ml av färsk medelstora tillbaka in i bioreaktor. Börja alltid med en mycket låg hastighet, särskilt vid pumpning av mediet tillbaka till bioreaktor.
- Ändra medelstora och komplettera askorbinsyra 2x/week. För att lägga till askorbinsyra, använd en 30 ml spruta för att ta ut 25ml av medium och lägg den åt sidan i vävnaden huva. Lös upp 25 mg askorbinsyra i 5 ml PBS och filtrera den genom ett 0,22 ìm filter. Först injicera den sterila askorbinsyra i sond och lägga tillbaka 25ml medel tas ut tidigare. Mediet receptet anges i tabell 1.
7. Representativa resultat:
Figur 1. Slangen och anslutningar för flödet systemet monteringen visas ovan.
Figur 2. Den silikon propp locket monteringen visas ovan.
Figur 3. Schema för bioreaktor monteringen visas ovan. Inne i bioreaktor Dacron manschetter fästs på glaset armar med den blå sutur knop.
Figur 4. Flow system anslutet till slangen och bioreaktor visas ovan. L/S18 slang kommer att pumpas genom en Masterflex pump och på så sätt påverka flödet. Tryckgivaren mäter trycket innan den bioreaktor på övre ström.
Figur 5. Bild av skördade konstruerade fartyg. Engineered fartygen ser ut att vara ogenomskinligt och uppnå en väggtjocklek av ca 250μm efter 8-veckors kultur i pulserande förhållanden.
Figur 6. Hematoxylin och eosin färgade tvärsnitt av tekniska fartyg. A och B är 8-veckors icke-pulsade och pulsade fartyg, respektive.C och D är 4-veckors icke-pulsade och pulsade fartyg, respektive. L visar luminala sidan av fartyg. Fjällen bar är 100μm.
Figur 7. Massons trikrom fläckar på kollagen (blå) för tvärsnitt av tekniska fartyg. A och B är 8-veckors icke-pulsade och pulsade fartyg, respektive. C och D är 4-veckors icke-pulsade och pulsade fartyg, respektive. Observera att 4-veckors pulsade fartyg visar mer kollagen än dess icke-pulserande motsvarighet. Vita pilarna pekar på återstående PGA fragment i fartygen. Fjällen bar är 100μm.
Figur 8. Immunkemi färgning av SMC markörer hos nötkreatur konstruerad artärerna. Smooth muscle α-aktin, calponin-1, och glatt muskulatur myosin heavy chain (SMMHC) är tidig, mellan-och sena SMC kontraktila markörer, respektive. I slutet av 12-veckors kultur, de celler i kärlväggen uttrycka SM α-aktin och måttliga mängder Calponin-1 och SMMHC. Fjällen bar är 20 mikroM.
| Komponent | Belopp |
| DMEM (DME / låg modifierad) | 500 ml |
| FBS (fetalt bovinserum) värmeinaktiverad | 100 ml |
| HEPES 1,0 M | 5ml |
| Vitamin C (löst i PBS eller DMEM) | 25 mg |
| Proline / Glycin / Alanine 25 mg/25 mg/10 mg (löst i 5 ml PBS) | 5ml |
| CuSO 4 1,5 mikrogram (löst IN1 ml PBS) | 1ml |
| Penicillin G på 10.000 enheter / ml | 5ml |
| PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB) vid 10ng/ml | 5 mikrogram |
| bFGF (grundläggande fibroblast growth factor) på 10ng/ml | 5 mikrogram |
Tabell 1. Komponenter av "4-10" medium visas i tabellen ovan. Med undantag av PDGF-BB och bFGF, alla andra komponenter som ska filtreras genom ett 0.2μm filter före användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvaliteten på konstruerade fartyg är till stor del styrs av kvaliteten på SMC används i vävnadskultur. Den kritiska aspekterna av SMC fenotyp inkluderar kontraktila morfologi, låg passage nummer, och förmågan att föröka sig inne i bioreaktor. Vi rekommenderar att passagen antalet inte vara större än P3 vid cellens kärna ur på polymeren schavotten. Dessutom är det viktigt att bekräfta att SMC källorna är mykoplasma fria före användning. Vi har observerat att mykoplasma-smittade celler leda till betydande minskningar av cellproliferation och kollagen matrix nedfall i bioreaktor kultur.
Mer än 400.000 kranskärl transplantat är behovet av bypass-operationer varje år, vilket resulterar i hög efterfrågan på liten diameter (<6 mm) vaskulära ympkvistar 12. Det slutliga målet är att ingenjör funktionell liten diameter fartyg som efterliknar fysiologiska funktioner infödda vävnad. Vårt pulserande bioreaktor system är en lovande betyder att utgöra funktionell arteriell transplantat som kan återställa och ersätta sjuka blodkärl. I ett kemiskt och mekaniskt kontrollerad miljö, gör det möjligt bioreaktor för oss att ingenjör implanterbara liten diameter fartyg som uppvisar stark sutur retention och goda mekaniska egenskaper. Den pulserande bioreaktor Systemet kan användas för att rekonstruera artärer från nötkreatur 3, svin 6,7 och mänskliga celler 9 i olika storlekar och dimensioner, vilket gör detta system generaliserbara och mångsidig. Dessutom har vi ändrat våra bioreaktor för att i realtid avbildning av vaskulära extracellulärt matrix, icke-invasivt 8. En kombination av åtgärder som våra bioreaktor, icke-invasiva mikroskopi avbildningstekniker, och avancerade biomekaniska bedömningar kommer hjälpa oss att förstå och utvärdera ECM nedfall och de förändringar i vaskulära mekaniska egenskaper över tiden.
Därför ger detta bioreaktor systemet en unik metod att konstruera biologiska-baserade vaskulära ympkvistar, som kan spela en viktig roll i autologa vaskulär transplantat förnyelse i framtida kliniska tillämpningar 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras av National Institutes of Health Grant R01 EB-008.836 och R01 HL083895 (både LEN). Vi kan tacka Daryl Smith, University Glasblåsarmästare, för att göra bioreaktorer för vår forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS (Fetal Bovine Serum) Heat-Inactivated | Hyclone | SH30071 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| rhFGF-basic | R&D Systems | 234-FSE | |
| rrPDGF-BB | R&D Systems | 520-BB | |
| Penicilin G | Sigma-Aldrich | PENNA | |
| Copper(II) Sulfate | Sigma-Aldrich | C8027 | |
| Gylcine | Sigma-Aldrich | C8790 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-25G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Silicone Stopper | Cole-Parmer | 06298-24 | |
| Masterflex tubes L/S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 | |
| Masterflex pump | Cole-Parmer | 7553-80 | |
| Dacron cuff | Maquet | 174406 | |
| PGA felt | Concordia | MO000877-01 | |
| 4-0 1.5 metric Surgipro II suture | Syneture | VP-557-X | |
| 6-0 0.7 metric Dexon suture | Syneture | 7538-11 | |
| 0.22μm PTFE filters | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
| Three Way Stop-cock | Edwards Lifesciences | 593WSC | |
| Pressure Transducer | Edwards Lifesciences | PX212 | |
| IV bags | Baxter Internationl Inc. | R4R2110 | |
| Saline dilution set | Arrow International | W20030 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain | F05027 |
References
- Risau, W., Flamme, I.
- Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion. Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).
- Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R.
- Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).
- Mitchell, S. L., Niklason, L. E. Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts. Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).
- Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries. Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).
- Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).
- Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valentín, A., Humphrey, J. D. Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).
- Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -c, Krause, D., Niklason, L. E. Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).
- Gong, Z. D., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs. Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).
- Poh, M. Blood vessels engineered from human cells. Lancet. 365, 2122-2124 (2005).
- American Heart Association. Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , American Heart Association. (2002).
