Summary
Onze groep heeft een bioreactor cultuur systeem dat bootst de fysiologische pulserende stress van het cardiovasculaire systeem te regenereren implanteerbare kleine diameter vaattransplantaten.
Abstract
Veel aandacht is besteed aan de ontwikkeling en vooruitgang van de methodologie te regenereren functionele kleine diameter arteriële omzeilt. In de fysiologische omgeving, zijn zowel mechanische en chemische prikkeling noodzakelijk om de goede ontwikkeling en functionaliteit van de arteriële vaten 1,2 te houden.
Bioreactor cultuur systemen ontwikkeld door onze groep zijn ontworpen om schepen regeneratie te ondersteunen binnen een nauwkeurig gecontroleerde chemo-mechanische omgeving nabootsen die van autochtone schepen. Onze bioreactor montage en onderhoud van de procedures zijn vrij eenvoudig en zeer herhaalbare 3,4. Gladde spiercellen (SMC) zijn gezaaid op een buisvormige polyglycolzuur (PGA), mesh, dat is voorzien van schroefdraad meer dan voldoet silicone en gekweekt in de bioreactor, met of zonder pulserende stimulatie voor maximaal 12 weken. Er zijn vier belangrijke attributen die onze bioreactor onderscheiden van een aantal voorgangers. 1) In tegenstelling tot andere cultuur systemen die alleen simuleren de biochemische omgeving van inheemse bloedvaten, onze bioreactor creëert ook een fysiologische pulserende omgeving door het toepassen van cyclische radiale belasting om de schepen in de cultuur. 2) Meerdere ontworpen schepen tegelijk worden gekweekt onder verschillende mechanische voorwaarden binnen een gecontroleerde chemische omgeving. 3) De bioreactor kan een mono-laag van endotheelcellen (EC) om eenvoudig worden bekleed op de luminale kant van de ontworpen schepen voor dierlijke implantatie modellen. 4) Onze bioreactor kan ook de cultuur ontworpen schepen met verschillende diameter grootte varieerden van 1 mm tot 3 mm, het opslaan van de inspanning om op maat elk individu bioreactor naar een specifieke diameter past.
De kunstmatige schepen gekweekt in onze bioreactor lijken inheemse bloedvaten histologisch tot op zekere hoogte. Cellen in de vaatwanden uitdrukkelijke volwassen SMC contractiele merkers zoals het gladde spierweefsel myosine zware keten (SMMHC) 3. Een aanzienlijke hoeveelheid collageen wordt afgezet binnen de extracellulaire matrix, die verantwoordelijk is voor de ultieme mechanische sterkte van de kunstmatige schepen 5. Biochemische analyse geeft ook aan dat collageen van gemanipuleerde schepen is vergelijkbaar met die van autochtone slagaders 6. Belangrijk is de pulserende bioreactor consequent geregenereerd schepen dat de mechanische eigenschappen die succesvolle implantatie experimenten mogelijk te maken in diermodellen 3,7 vertonen. Bovendien kan deze bioreactor verder worden aangepast om real-time de beoordeling en het bijhouden van collageen remodeling na verloop van tijd, niet-invasieve manier, met behulp van een niet-lineaire optische microscopie (NLOM) 8 mogelijk te maken. Tot slot moet dit bioreactor dienen als een uitstekend platform om de fundamentele mechanismen die de regeneratie van functionele kleine diameter vaattransplantaten reguleren te bestuderen.
Protocol
Autoclaaf
Monteer en autoclaaf de buizen voor de stroom-systeem en bioreactor componenten (bioreactor zelf en de silicone stop deksel) zoals aangegeven in figuur 1 en figuur 2. Sonde heeft een mannelijke connector aan het ene uiteinde en een open eind aan de andere kant. Drie korte slang segmenten worden ingebracht via een silicone cap voor gasuitwisseling.
1. Naaien PGA Mesh
- Gesneden PGA gaas 1,1 cm x ~ 8cm vel (afhankelijk van de bioreactor formaat).
- Schoon silicone (3mm inwendige diameter) met gedestilleerd water (dH20) en de lucht drogen voor gebruik.
- Gebruik Dexon 6,0 hechtdraad tot PGA mesh naaien rond de schone silicone slangen te beginnen met drie chirurgische knopen, gevolgd door enkele steken.
2. PGA Steigers Surface Treatment
- Dip PGA steigers in 1M NaOH voor 1-2min en registreren van de behandeling de tijd en gebruik dezelfde tijd voor alle PGA steigers.
- Spoel PGA steigers in dH2O baden voor 2 minuten 3 keer.
- Pat PGA steigers droog met Kimwipes tussen elke duik in dH 2 O baden.
- Droge PGA steigers onder weefselkweek motorkap te droge lucht gedurende 15 minuten met een blower op.
3. Naaien Dacron armen
- Gebruik Prolene 4,0 hechtdraad tot kleine stukjes van Dacron manchetten (1cm) naaien op elk uiteinde van de PGA gaas met een overlap van 2-3mm. Let op: wees niet te doorboren silicone (figuur 3).
- Gebruik dezelfde hechtdraad tot drie steken naaien rond het vrije uiteinde van Dacron manchetten. Zorg ervoor dat u voldoende hechtingen vertrekken op de vrije uiteinden van Prolene hechtdraad voor stap 5.1 (figuur 3).
4. Vergadering van Bioreactor (Dag voor het begin van bioreactor cultuur)
- Soak genaaid mesh en siliconen slangen, chirurgische instrumenten, en een dunne draad in een 70% ethanol bad voor 20-30 minuten.
- Open de autoclaaf zakjes met daarin de bioreactor en dompel het in 70% ethanol bad gedurende tenminste 30 minuten voor de montage. Zorg ervoor dat de bioreactor grondig te spoelen met ethanol. Blootstelling van alle bioreactor componenten tot 70% ethanol is een aanvulling sterilisatie stap. Deze stap verwijdert ook endotoxine, die niet wordt verwijderd door autoclaveren en is schadelijk voor de vasculaire cellen.
- Trek de silicone slang door zij-armen met behulp van dunne draad te trekken door.
- Neem de bioreactor van ethanol bad (houden mesh ondergedompeld in ethanol). Bevestig de PGA schavot in de bioreactor door het aandraaien van Dacron manchetten over de uitlopende glazen lippen door aanscherping en het vastbinden van de Prolene hechtingen (figuur 3).
- Sluit een kant van de bioreactor zijarmen aan op de connectoren via silicone.
- Trek andere kant van siliconen buis met voldoende spanning en voeg de resterende twee connectors in silicone. Houd vast aan silicone goed bij het plaatsen van connectoren!
- Plaats bioreactor in ethanol bad en spoelen met ethanol door het voorzichtig connectors uit de zijarmen.
- Flip bioreactor op en laat een weken gedurende 10 minuten.
- Flip bioreactor op de kop te genieten en voor een extra 10 minuten.
- Giet alle ethanol.
- Opzetten van drie grote petrischalen (10 cm) in serie en plaats bioreactor in het centrum schotel te houden van de overtollige ethanol droop van de uiteinden van de buizen.
- Flush bioreactor en PGA mesh met weefselkweek water met behulp van een 5 ml of 10 ml pipet. Ook spoelen weefselkweek water in silicone.
- Goed uitlekken alle overtollige water in petrischaaltjes aan beide zijden van de bioreactor.
- Droge bioreactor overnachting in kap met blower aan en UV-OFF.
- Aanvullende opmerkingen: zorg ervoor dat steriele roer bar is in de bioreactor. Zorg ervoor dat niet te "zweven" over de bioreactor vanaf dit punt naar voren, om besmetting te voorkomen. Cut-up veel parafilm strips en week ze in een kleine 70% ethanol bad (grote petrischaal werkt goed).
5. Dag 1: Bioreactor Setup
- Plaats een steriele petrischaal meer dan opening van elk bioreactor op de PGA steiger binnenkant te beschermen tegen verontreinigingen.
- Monteer flow systeem om bioreactor zoals aangegeven in figuur 4 en parafilm de verbinding gewrichten.
- Veeg connectors eerst met alcohol doekjes.
- Bevestig de injectiepoort aan derden, niet-gebruikte arm van bioreactor.
- Verwijder de walrus slangen en stropdas af blauwe eind van zoutoplossing verwatering te stellen zo dicht mogelijk bij Y-splitsing mogelijk te maken. Trek slangklem op zijn plaats geen vloeistof dragen ervoor te zorgen dat dit deel van de buis
- Verwijderen IV tas, en hechten walrus slang (rood) tot einde van IV tas. Zorg ervoor dat het inbrengen poort vegen met alcohol eerste vegen.
- Bevestig walrus aan de ene kant van de stroom-systeem (via witte uiteinde buis).
- Plaats 3-weg kraan in stromen systeem.
- Verwijder de drukopnemer en verbinding te maken met drie-weg kraan.
- Bevestig andere uiteinde van de drukopnemer tot midden opening in de tas.
- Aansluitende bioreactor om de stroom systeem via de Y-splitsing. Gebruik een 60ml spuit 350 ml van 1% fungizone (mix 5 ml fungizone met 495ml van PBS) aan IV zak.
- Knijp IV zak aan de vloeiende systeem spoelen door het aanpassen van de afsluitkranen om stroom van PBS mogelijk te maken. Let op: Controleer de binnenkant van bioreactor om te verzekeren dat er geen lekken.
- Re-schorten 8 x10 6 SMC (ongeveer een confluent T75) in 1,25 ml van middelgrote en zaad op elke PGA scafffold. Zorg ervoor dat celsuspensie is gelijkmatig is gedruppeld op de PGA mesh-Dacron kruising evenals op de onderkant van PGA mesh.
- Veeg rand van bioreactor met een alcoholdoekje via het draaien van de bioreactor zijwaarts te voorkomen zweven.
- Siliconen stop deksel montage (figuur 2)
- Peel autoclaaf tas voorzichtig terug en zorg ervoor niet naar onderkant bloot van het deksel.
- Bevestig injectie poort voedingssonde bij de mannelijke connector.
- Bevestig PTFE 0,20 micrometer filters aan elk van de drie luchthavens.
- Wees niet te bloot / touch onderkant van het deksel tijdens dit proces.
- Parafilm de injectiepoort.
- Plaats de siliconen stop deksel in glas bioreactor en zorg ervoor dat de sonde in de bioreactor niet de geplaatste PGA steigers aan te raken. Parafilm rond het deksel.
- Plaats bioreactor met de stroom-systeem in de incubator (op de zijkant) en draai de bioreactor elke 5 minuten voor 25-30 minuten.
- Vul de bioreactor kamer met 400 ml van onze cultuur 4-10 media, zoals beschreven in (tabel 1). Deze cultuur medium is "geoptimaliseerd" voor varkens ontworpen slagaders.
6. Dag 6-7: Draaien op de pomp, en de eerste voeding
- Statisch groeien de geplaatste steigers zonder enige pulserende pompen door de silicone pompslang voor 6-7 dagen. Er is geen noodzaak voor middelgrote wijzigen of vitamine C suppletie gedurende deze tijd.
- Zorg ervoor dat er geen lekken zijn van PBS of knikken van flow systeem buizen voor het inschakelen van de pomp.
- Zet de pomp van de stroom-systeem en zorg ervoor dat de pomp instellen, zodat aan te passen, dat de druk leest ongeveer 270/-30mmHg.
- Record druk dagelijks in heel de cultuur en onderhouden van de druk op 270/-30mmHg. Drukopnemer kan worden aangesloten op een computer te lezen en bewaken van de druk.
Eerste voeding
- Monteer injectiepoort & PTFE-filter op het voeden deksels voor zowel de middellange verandering en middelgrote afval deposal doeleinden.
- Plaats de sonde stevig op de pomp en steek het ene uiteinde het voeden van de haven van de bioreactor en het andere uiteinde op de voeding deksel. Zorg ervoor dat u de injectie poorten af met ethanol doekjes.
- Gebruik een dual-directionele Masterflex pomp naar pomp uit 200 ml medium. Maak dan gebruik van een nieuwe sonde terug te pompen 200 ml vers medium in de bioreactor. Begin altijd met een zeer lage snelheid, in het bijzonder bij het verpompen medium terug naar de bioreactor.
- Verandering medium en aan te vullen ascorbinezuur 2x/week. Toe te voegen ascorbinezuur, gebruik dan een 30ml spuit tot het afsluiten van 25 ml van middelgrote en plaats gereserveerd in het weefsel kap. Los 25 mg ascorbinezuur in 5 ml PBS en filter het door een 0,22 urn filter. Eerste injecteren de steriele ascorbinezuur in de sonde en voeg de rug van de 25 ml medium genomen eerder. Het medium recept is weergegeven in tabel 1.
7. Representatieve resultaten:
Figuur 1. De slangen en aansluitingen voor de stroom-systeem montage is hierboven weergegeven.
Figuur 2. De siliconen stop deksel montage is hierboven weergegeven.
Figuur 3. Schema's van de bioreactor vergadering worden hierboven getoond. In de bioreactor Dacron manchetten zijn bevestigd op het glas armen met de blauwe hechtdraad knopen.
Figuur 4. Flow systeem is aangesloten op buizen en bioreactor is hierboven weergegeven. L/S18 buis wordt gepompt door een Masterflex pomp en daarmee het besturen van de stroom. De druk transducer meet de druk voor het invoeren van de bioreactor op de bovenste stroom.
Figuur 5. Afbeelding van geoogst ontworpen schip. Engineered schepen zullen blijken te zijn ondoorzichtig en het bereiken van een wanddikte van ongeveer 250μm na 8-week cultuur onder pulsatiele omstandigheden.
Figuur 6. Hematoxyline en eosine gekleurde doorsneden van gemanipuleerde schepen. A en B zijn 8-weekse niet-gepulste en gepulste schepen, respectievelijk.C en D zijn 4-week niet-gepulste en gepulste schepen, respectievelijk. L geeft aan de luminale zijde van de schepen. De schalen bar is 100 urn.
Figuur 7. Trichroom vlekken Masson voor collageen (blauw) voor de doorsneden van gemanipuleerde schepen. A en B zijn 8-weekse niet-gepulste en gepulste schepen, respectievelijk. C en D zijn 4-week niet-gepulste en gepulste schepen, respectievelijk. Merk op dat de 4-week gepulste schip meer collageen dan de niet-gepulste tegenhanger shows. Witte pijlen wijzen om de resterende PGA fragmenten in de schepen. De schalen bar is 100 urn.
Figuur 8. Immunochemie kleuring van SMC markers bij runderen ontworpen slagaders. Gladde spier α-actine, calponin-1, en het gladde spierweefsel myosine zware keten (SMMHC) zijn vroege, intermediaire en late SMC contractiele markers, respectievelijk. Tegen het einde van de 12-week cultuur, de cellen in de vaatwand Express SM α-actine en matige hoeveelheden Calponin-1 en SMMHC. De schalen bar is 20μm.
| Bestanddeel | Aantal |
| DMEM (DME / laag gemodificeerd) | 500 ml |
| FBS (foetaal runderserum) warmte geïnactiveerd | 100 ml |
| HEPES 1,0 M | 5ml |
| Vitamine C (opgelost in PBS of DMEM) | 25 mg |
| Proline / Glycine / Alanine 25 mg/25 mg/10 mg (opgelost in 5 ml PBS) | 5ml |
| CuSO 4 1,5 microgram (opgelost in 1 ml PBS) | 1ml |
| Penicilline G bij 10.000 eenheden / ml | 5ml |
| PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB) op 10ng/ml | 5μg |
| bFGF (basic fibroblast growth factor) bij 10ng/ml | 5μg |
Tabel 1. Componenten van "4-10" medium worden weergegeven in de bovenstaande tabel. Met uitzondering van de PDGF-BB en bFGF, alle andere componenten moeten worden gefilterd door een 0.2μm filter voorafgaand aan gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kwaliteit van de schepen is ontworpen voor een groot deel bepaald door de kwaliteit van de SMC's gebruikt in de weefselkweek. De kritische aspecten van het SMC fenotype zijn contractiele morfologie, lage passage nummer, en de mogelijkheid om woekeren in de bioreactor. Wij bevelen aan dat de passage aantal niet groter is dan P3 op het moment van de cel zaaien op het polymeer schavot. Bovendien is het cruciaal om te bevestigen dat de SMC bronnen voor mycoplasma gratis te gebruiken. We hebben geconstateerd dat mycoplasma-besmette cellen leiden tot een aanzienlijke verlaging van de cellulaire proliferatie en collageen matrix depositie in bioreactor cultuur.
Meer dan 400.000 coronaire enten zijn nodig voor bypass-operaties per jaar, wat resulteert in een grote vraag naar kleine diameter (<6mm) vaattransplantaten 12. Het uiteindelijke doel is om engineer functioneel kleine diameter schepen die de fysiologische functies van inheemse weefsel na te bootsen. Ons pulsatiele bioreactor systeem is een veelbelovend middel om de functionele arteriële grafts dat zou kunnen herstellen en vervangen van zieke slagaders vormen. In een chemisch en mechanisch gecontroleerde omgeving, de bioreactor kunnen we engineer implanteerbare kleine diameter schepen die sterke hechtdraad retentie en uitstekende mechanische eigenschappen vertonen. Het pulserende bioreactor systeem kan worden gebruikt om de slagaders te reconstrueren van runderen 3, varkens 6,7, en menselijke cellen 9 in diverse maten en afmetingen, waardoor dit systeem generaliseerbaar en veelzijdig. Daarnaast hebben we onze aangepast bioreactor om real-time beeldvorming van vasculaire extracellulaire matrix, non-invasief 8 mogelijk te maken. Een gecombineerde aanpak van onze bioreactor, niet-invasieve beeldvorming microscopie technieken en geavanceerde biomechanische evaluatie zal ons helpen begrijpen en ECM-depositie en de veranderingen te evalueren in de vasculaire mechanische eigenschappen in de tijd.
Daarom heeft dit bioreactor systeem biedt een unieke benadering van de biologische basis van vaattransplantaten ingenieur, die een belangrijke rol kan in autologe vaattransplantaten regeneratie spelen in de toekomstige klinische toepassingen 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt gefinancierd door National Institutes of Health Grant R01 EB-008836 en R01 HL083895 (zowel voor LEN). We zouden graag Daryl Smith, de Universiteit Glassblower, bedanken voor het maken van de bioreactoren voor ons onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS (Fetal Bovine Serum) Heat-Inactivated | Hyclone | SH30071 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| rhFGF-basic | R&D Systems | 234-FSE | |
| rrPDGF-BB | R&D Systems | 520-BB | |
| Penicilin G | Sigma-Aldrich | PENNA | |
| Copper(II) Sulfate | Sigma-Aldrich | C8027 | |
| Gylcine | Sigma-Aldrich | C8790 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-25G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Silicone Stopper | Cole-Parmer | 06298-24 | |
| Masterflex tubes L/S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 | |
| Masterflex pump | Cole-Parmer | 7553-80 | |
| Dacron cuff | Maquet | 174406 | |
| PGA felt | Concordia | MO000877-01 | |
| 4-0 1.5 metric Surgipro II suture | Syneture | VP-557-X | |
| 6-0 0.7 metric Dexon suture | Syneture | 7538-11 | |
| 0.22μm PTFE filters | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
| Three Way Stop-cock | Edwards Lifesciences | 593WSC | |
| Pressure Transducer | Edwards Lifesciences | PX212 | |
| IV bags | Baxter Internationl Inc. | R4R2110 | |
| Saline dilution set | Arrow International | W20030 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain | F05027 |
References
- Risau, W., Flamme, I.
- Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion. Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).
- Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R.
- Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).
- Mitchell, S. L., Niklason, L. E. Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts. Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).
- Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries. Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).
- Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).
- Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valentín, A., Humphrey, J. D. Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).
- Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -c, Krause, D., Niklason, L. E. Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).
- Gong, Z. D., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs. Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).
- Poh, M. Blood vessels engineered from human cells. Lancet. 365, 2122-2124 (2005).
- American Heart Association. Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , American Heart Association. (2002).
