天堂斑马鱼的细胞标记与激光Uncagable荧光葡聚糖

Summary

该协议描绘的方式，标签和跟踪的小斑马鱼的胚胎细胞群体，使用紫外线uncaging笼荧光，整个装载免疫标记uncaged荧光信号放大的命运。

Abstract

发育生物学中的一个核心问题是演绎出无数的细胞类型，目前他们未分化的前体出现在脊椎动物的起源。研究人员所采用的谱系标签的各种方法，如DII ^标签 1和压力注射溯源^酶 2的模型系统开发的后期阶段，以确定细胞的命运。在斑马鱼（ 斑马鱼 ）的第一命运地图iontophoretic注射荧光染料如罗丹明右旋糖酐，组装，成单细胞在胚胎的离散地区和追踪标记细胞的命运，随着^时间的推移3-5。这些方法虽然有效，技术要求高，需要专门的设备，不常用的斑马鱼实验室发现。最近，photoconvertable荧光蛋白，如EOS和枫，不可逆转的交换机从绿色变为红色荧光，当暴露在紫外线，增加使用在斑马^鱼 6-8 。光学清晰度的转基因斑马鱼的胚胎和相对缓和这些谱系标签特别有吸引力的工具，并观察细胞的迁移^，在体内7。尽管它们的效用，这些蛋白质有一些缺点相比，染料介导的宗族标记方法。最关键的是我们在发现这些蛋白质的光转化过程中获得3 - D分辨率高的困难。在这一点上，也许在斑马鱼的血统标签的决议和易用性的最佳结合 ​​，使得使用笼荧光葡聚糖，一种荧光染料，势必淬火组^口罩荧光9。染料就可以“uncaged”（从淬火组发布）在一个特定的细胞使用激光或水银灯紫外线光，使荧光或免疫检测的可视化。笼荧光iontophoretic方法不同，可注射用标准的注射器具，并配备了^一个针孔10 epifluorescence显微镜uncaged。此外，对荧光抗体检测只有uncaged形式，和抗原表位生存固定以及^11。最后，笼中的荧光可以被激活，具有非常高的3 - D分辨率，特别是如果采用双^光子显微镜12,13。这个协议描述笼荧光和激光uncaging宗族标签的方法。 Subsequenctly，uncaged荧光检测如GFP的其他抗原表位，同时通过与抗体标签。

Protocol

1。笼中的荧光素葡聚糖的合成

1. 测量出3.5 - aminodextran 4毫克，并添加到含1毫克的CMNB笼荧光SE的Invitrogen公司提供的有色管。在我们的手中，这一比例给出了一个〜2.5％，染料分子右旋糖酐的平均装载。
2. 加入500μL0.1 M的NA ₂ B ₄ O _7（四硼酸钠）缓冲区管。
3. 第旋涡30秒解散aminodextran笼荧光。
4. 让我们在涡旋混合器反应过夜。
5. 拧断则巴自旋列底部封闭和放松的上限。标记一个点上用毡尖笔列。将列在15 mL锥形管。
6. 在1000 XG离心机面临的转子中心的点为2分钟。压实后，立即使用列。
7. 放置在一个新的15 mL锥形管压实列。
8. 池反应混合物压实列树脂床的中心转移到。更换盖。
9. 在1000 XG离心机面临的转子中心的点为2分钟。分拆后，洗脱液和列的顶部将大致颜色相同的黄色阴影。
10. 黄色洗脱液（〜350μL）转移到1.5 ml离心管。
11. 冻干以干燥在speedvac。盖用铝箔纸speedvac。
12. 重新暂停导致〜苍白黄泡在水中2-3毫克到终浓度为1％W / V
13. 在铝箔盖管，储存在-20 ° C的这一解决方案。这是一个好主意，以等分葡聚糖的解决方案，以防止重复冻融。

2。笼中的荧光素葡聚糖注射到斑马鱼胚胎

1. 在0.2M氯化钾稀释1％W / V股票笼荧光葡聚糖1:5或1:10。
2. 注入0.5 - 笼入蛋黄细胞阶段的胚胎使用高压注射器的荧光解决方案1.0nL。一旦注入，胚胎离合器必须保持在28.5 ° C至减少非特异性uncaging在黑暗中。
3. 手动移除胚胎chorions。
4. 麻醉在4％tricaine的胚胎。
5. 胚胎将被安装在0.8％琼脂糖35mmx10mm培养皿中，然后盖上蛋水。
6. 至少15分钟，在50 ° C的热块平衡融化的琼脂糖。
7. 使用的玻璃吸管，吸取少量的水的一个胚胎，并释放到琼脂糖注：这是很重要的冷却琼脂糖管你的手，约30秒前把该管的胚胎，以避免杀死胚胎。
8. 移液器从试管胚胎，约琼脂糖50μL和弹出到培养皿的中心内容。
9. 快速定位与uncaged面临细胞的胚胎，使用一个塑料螺纹注 ：酷很快，所以仓促定向胚胎琼脂糖。如果操纵琼脂糖变得僵硬后，可能会损坏胚胎。
10. 允许琼脂糖完全巩固（这需要几分钟），并填写菜三分之二与鸡蛋的水含有tricaine 4％和0.003％机动部队。

3。激光荧​​光素葡聚糖Uncaging

1. uncaging使用显微镜必须有一个40倍的水浸泡的目标。
2. 我们用365 nm的染料细胞和70％/ 30％的分裂分色镜的光电子仪器的激光。
3. uncaging之前，激光必须作出的目标和衰减到合适的电源的齐焦。
4. 要集中的激光，将根据客观镜像玻片上，重点目标，直到在幻灯片的划痕可见。
5. 调整激光衰减器，直到激光可以产生清晰可见，在单脉冲镜从头。
6. 向上和向下调整的目标重点。如果激光可以产生了一个从无到有的目标是重点，调整激光的聚焦¼交替上升或下降。重复，直到激光可以从头开始的目标是只有当聚焦镜。
7. 根据uncaged面积的目标和重点地点安装胚胎。
8. 要uncage，着眼于利益的一个单元格，并在2-3赫兹脉冲的10-20倍。
9. uncaging后，免费的胚胎剥离琼脂糖钳和把鸡蛋水含有0.003％机动部队。让胚胎的发展，直到它们被固定在光紧框。

4。抗体标记的Uncaged荧光素葡聚糖检测

1. 修复胚胎在AB固定液（4％多聚甲醛，氯化钙_为0.3mm 2，8％的蔗糖，1X的磷酸盐缓冲生理盐水，pH值7.3），两到四个小时，在室温（RT）或隔夜（O / N）在4 ° C所有标签的​​步骤，应保持轻紧框或铝箔包裹管的胚胎。
2. 删除固定液，用100％甲醇取代，在室温下10分钟离开，除去甲醇和replaCE新鲜100％甲醇。
3. 商店在-20 ° C，在甲醇至少30 分钟注 ：您可以存储长达两个星期之前抗原表位在甲醇开始降低。
4. 补充水分胚胎在室温洗涤5分钟，75％MeOH/1X磷酸盐缓冲生理盐水，0.1％吐温20（1X PBSTw），然后50％MeOH/50％1XPBTw，然后MeOH/75％1X PBSTw 25％。
5. 在1XPBSTw 5分钟内清洗三次。
6. 如果胚胎> 24小时，permiabilize 10μg/ mL的蛋白酶K在1XPBSTw胚胎。 Permiabilization时间是在舞台上的依赖。五分钟蛋白酶K是足够的，如果胚胎受精后（HPF）是24至48小时。如果年纪较大的幼虫，可能需要更多的时间。重新修复抗体固定液在室温下20分钟
7. 在1XPBSTw 5分钟，在室温下清洗5次。
8. 孵育块解决方案（1XPBS，0.1％的Triton X100，10％羊血清，10％的牛血清蛋白，1％二甲基亚砜）在室温下1-2小时。
9. 封闭液稀释的抗体（抗荧光素加抗细胞类型特异性标志物抗体）。
10. 孵育胚胎O / N在4 ° C在含初级抗体的解决方案。
11. 清洗四次，在1XPhosphate 20分钟的缓冲生理盐水，0.1％的Triton X100（PBSTx）在室温下。
12. 在封闭液稀释的荧光标记抗体（通常为1:300）。
13. 孵育O / N在4 ° C在含有二级抗体的解决方案。
14. 在室温下在1XPBSTx 20分钟清洗四次。
15. 清除在50％glycerol/50％，在室温下至少有两个小时1XPBS的胚胎，然后取出甘油/ PBS混合，添加100％的甘油，让站在O / N 4 ° C。

5。代表性的成果：

免疫标记后，应该有一个uncaged（Figure.1）细胞染色丰富的区域。这是很平常看到一个比较高的信噪比> 48小时老斑马鱼，由于荧光素的自发uncaging。

图1。传承的斑马鱼松果体复杂的标签。 HPF，24岁的前松果体原基的部分，foxd3表示：GFP的表达，uncaged使用紫外激光脉冲通过48hpf），左路集群的细胞称为parapineal（红色圆圈）已经摆脱了uncaged域（白色圆圈），B）Uncaged的荧光信号是丰富parapineal（红圈）和松果体器官（白色圆圈） 。

Discussion

如上所述，这个协议提供了相对快速的血统在斑马鱼标记法，显微注射法，显微镜，免疫后的常用技巧。我们发现，激光uncaging是最有效和最具成本效益的方式uncage在本地化时尚的荧光。这种方法可用于实验端点4 DPF后期谱系标签。然而，细胞分裂时，每个单元的笼荧光素浓度，最终跌幅超过检测水平。此外，已经出现了自发的，非特异性荧光uncaging的斑马鱼^幼虫 11的报告。因此，u​​ncaged荧光检测是最有效的早期幼虫期（48-72 HPF）或更早版本。

我们的首选uncaging方法是通过使用一个脉冲氮激光。这些常用的细胞消融实验，并不够准确uncage燎细胞或小群体^细胞 11-12 。但是，uncaging也可以通过使用共聚焦显微镜，双光子共聚焦显微镜被用来实现非常精确的uncaging ^12。在光谱的另一端，如果不需要精密激光是可有可无的。用DAPI过滤器设置配备一个啶显微镜可用于uncage通过一个小针孔^11。

我们发现，uncaged荧光检测，使用的主要抗体和荧光二抗，在红光或远红光的波长（如Alexa的633）最适合我们的需求发出。这使我们能够区分uncaged一个转基因（图1）所表达的GFP的荧光。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
Aminodextran, 10kDa	Invitrogen	D1860
Zeba desalt spin columns	Pierce, Thermo Scientific	89889
goat anti-fluorescein antibody	Invitrogen	A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody	Invitrogen	A21082
35mmx10mm petri dishes	BD Biosciences	351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective	Leica Microsystems	DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System	Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Proteinase K	Roche Group	03115836991
Plastic thread	Any Supplier
Agarose	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
Vortexing mixer	VWR international	Vortex Genie 2
Pressure injector	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3