本方案阐述了一种利用紫外光解笼释放荧光素的方法，对斑马鱼胚胎中少量细胞进行标记并追踪其命运，随后通过整体免疫标记放大光解后荧光素的信号。
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摘要
摘要
发育生物学中的一个核心问题是推断脊椎动物中众多细胞类型的起源，即这些细胞如何从非特化的前体细胞逐步产生。研究人员已采用多种谱系标记方法，例如DiI标记1和可追踪酶的压力注射2，以确定模式生物在发育后期阶段的细胞命运。最早的斑马鱼（Danio rerio）命运图谱是通过在胚胎特定区域的单个细胞中电泳注射荧光染料（如罗丹明葡聚糖），并随时间追踪标记细胞的归宿而建立的3-5。尽管这些方法有效，但其技术要求较高，且需要斑马鱼实验室中通常不具备的专用设备。近年来，光转化荧光蛋白（如Eos和Kaede）在斑马鱼中的应用日益广泛6-8，这类蛋白在紫外光照射下会不可逆地从绿色荧光转变为红色荧光。由于斑马鱼胚胎具有良好的光学通透性，且转基因操作相对简便，这些工具特别适用于体内细胞谱系标记及细胞迁移的观察in vivo7。尽管如此，与染料介导的谱系标记方法相比，这些蛋白仍存在一些不足。其中最关键的是我们在进行蛋白光转化时难以获得高精度的三维分辨率。在此背景下，目前用于斑马鱼谱系标记、兼具高分辨率与操作便捷性的最佳选择可能是使用笼锁型荧光素葡聚糖（caged fluorescein dextran）——一种与淬灭基团结合而使其荧光被屏蔽的荧光染料9。该染料可通过激光或汞灯发出的紫外光在特定细胞内“解笼”（即从淬灭基团中释放），从而使其荧光得以显现或可通过免疫学方法检测。与电泳注射法不同，笼锁型荧光素可使用常规显微注射装置注入，并借助带针孔的落射荧光显微镜进行解笼10。此外，抗荧光素抗体仅识别解笼后的形式，且该抗原表位在固定过程中保持稳定11。最后，笼锁型荧光素可实现极高的三维分辨率激活，尤其是在采用双光子显微镜时效果更佳12,13。本实验方案描述了利用笼锁型荧光素及激光解笼进行谱系标记的方法，并进一步通过抗体标记实现解笼后荧光素与其他抗原表位（如GFP）的同步检测。
方案
1. 笼锁型荧光素葡聚糖的合成
- 称取 3.5 - 4 mg 氨基葡聚糖，加入 Invitrogen 提供的避光管中，管内含有 1 mg CMNB 保护的荧光素琥珀酰亚胺酯。据我们经验，该比例可实现平均每分子葡聚糖偶联约 2.5 个染料分子。
- 向管中加入 500 μL 0.1 M Na2B4O7（硼酸钠）缓冲液。
- 盖紧管盖，涡旋振荡 30 秒，使氨基葡聚糖和保护型荧光素充分溶解。
- 在涡旋混合器上反应过夜。
- 拧下 Zeba 离心柱底部的封闭端，松开上端盖子。用记号笔在柱体上标记一个点。将柱体放入一个 15-mL 圆锥形离心管中。
- 以 1000 × g 离心 2 分钟，标记点朝向转子中心。柱体压缩后应立即使用。
- 将压缩后的柱体转移至一个新的 15-mL 圆锥形离心管中。
- 合并反应混合物，并转移至压缩柱树脂床的中心位置。盖上盖子。
- 以 1000 × g 离心 2 分钟，标记点朝向转子中心。离心后，流出液与柱体上部颜色应大致呈现相同深浅的黄色。
- 将黄色流出液（约 350 μL）转移至 1.5-mL 微量离心管中。
- 在真空浓缩仪中冻干至完全干燥。用铝箔覆盖真空浓缩仪。
- 将所得的约 2-3 mg 浅黄色泡沫重新溶于水，配制成终浓度为 1%....
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讨论
如所述，本方案提供了一种相对快速的斑马鱼谱系标记方法，该方法基于常用的显微注射、显微观察和免疫荧光技术。我们发现，激光解笼是局部解笼荧光素最高效且成本效益最高的方式。该方法可用于实验终点长达4天的谱系标记。然而，随着细胞分裂，每个细胞中的笼锁荧光素浓度最终会降低至无法检测的水平。此外，已有文献报道在斑马鱼幼体中存在自发性、非特异性的荧光素解笼现象11。因此，对解笼荧光素的检测在早期幼体阶段（48–72小时）或更早时期最为有效。
我们首选的解笼方法是使用脉冲氮激光器。这类激光器通常用于细胞消融实验，能够准确定位并解笼单个细胞或少量细胞群11-12。然而，解笼也可以通过共聚焦显微镜实现；双光子共聚焦显微镜已被用于实现极为精确的解笼12。在另一端，如果不需要高精度，则可以不使用激光器。配备DAPI滤光片组的落射荧光显微镜可通过一个小针孔实现解笼11。
我们发现，使用一抗检测去笼化荧光素，并结合在红色或远红波长（例如 Alexa 633）发射荧.......
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致谢
我们感谢 Dan Carlin 在制备笼锁型荧光素方面提供的帮助。此外，我们还要感谢以下资助来源：Vanderbilt 大学医学院发育生物学培训项目对 JAC 的资助，以及 NIH HD054534 对 JTG 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CMNB-笼锁型荧光素 SE | Invitrogen | C20050 | |
| 氨基葡聚糖，10 kDa | Invitrogen | D1860 | |
| Zeba 脱盐离心柱 | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| 山羊抗荧光素抗体 | Invitrogen | A11095 | |
| Alexa Fluor 633 驴抗山羊抗体 | Invitrogen | A21082 | |
| 35 mm × 10 mm 培养皿 | BD Biosciences | 351008 | |
| 配备 40 倍水浸物镜的直立复合显微镜 | Leica Microsystems | DM6000B | |
| MicroPoint 手动激光照射系统 | Photonic Instruments | ||
| 苯硫脲（PTU） | Alfa Aesar | L06690 | |
| 三卡因 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 蛋白酶 K | Roche Group | 03115836991 | |
| 塑料细线 | 任意供应商 | ||
| 琼脂糖 | Research Products International Corp. | A20090 | |
| 真空离心浓缩仪 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Savant SPD131DDA | |
| 涡旋混合器 | VWR international | Vortex Genie 2 | |
| 压力注射仪 | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
参考文献
- Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
- Wetts, R., Fraser, S. E.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran
Posted by JoVE Editors on 5/25/2011. Citeable Link.
A correction was made to Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to:
Ilya A. Shestopalov and James K. Chen
instead of:
Ilya Shestopalov and James Chen
