Lineage Labeling van de zebravis Cellen met Laser Uncagable Fluoresceïne Dextran

Summary

Dit protocol schetst een manier om de label en sporen het lot van kleine groepjes cellen zebravis embryo's met behulp van UV-uncaging van gekooide fluoresceïne, gevolgd door een hele berg immunokleuring om het signaal van de Uncaged fluoresceïne versterken.

Abstract

Een centraal probleem in de ontwikkelingsbiologie is af te leiden van de oorsprong van de talloze soorten cellen aanwezig zijn in gewervelde dieren als ze voortvloeien uit ongedifferentieerde precursoren. Onderzoekers hebben gebruikt verschillende methoden van afkomst etiketteren, zoals DII etikettering ¹ en de druk injectie van herleidbaar enzymen ² om na te gaan lot van de cel in latere stadia van de ontwikkeling in model systemen. Het eerste lot kaarten in zebravis (Danio rerio) werden samengesteld door iontoforetische injectie van fluorescerende kleurstoffen, zoals rhodamine dextran, in enkele cellen in discrete gebieden van het embryo en het opsporen van de gelabelde cel lot na verloop van tijd ^3-5. Hoewel effectief, worden deze methoden technisch veeleisend en vereist gespecialiseerde apparatuur die niet vaak gevonden in de zebravis labs. Onlangs zijn photoconvertable fluorescerende eiwitten, zoals de Eos en Kaede, die onomkeerbaar van groen naar rood fluorescentie wanneer blootgesteld aan ultraviolet licht, het zien van het toenemend gebruik in zebravis ^6-8. De optische helderheid van de zebravis embryo en het relatieve gemak van transgenese hebben deze bijzonder aantrekkelijke tools voor lineage etikettering en de migratie van cellen te observeren in vivo ^7. Ondanks hun nut hebben deze eiwitten ten opzichte van een aantal nadelen met dye-gemedieerde lijn labeling methoden. Het belangrijkste is dat het moeilijk we hebben gevonden in het verkrijgen van een hoge resolutie 3-D tijdens de photoconversion van deze eiwitten. In dit licht, misschien wel de beste combinatie van resolutie en het gebruiksgemak voor de lijn de etikettering in de zebravis maakt gebruik van gekooide fluoresceïne dextran, een fluorescente kleurstof die is gebonden aan een quenching groep die maskers zijn fluorescentie ^9. De kleurstof kan dan "Uncaged" (vrij uit de quenching-groep) worden binnen een specifieke cel met behulp van UV-licht van een laser of kwiklamp, waardoor visualisatie van de fluorescentie of immunodetectie. In tegenstelling tot de iontoforetische methoden, kan gekooide fluoresceïne worden geïnjecteerd met standaard injectie apparaten en Uncaged met een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een pinhole ^10. Daarnaast, antistoffen tegen fluoresceïne detecteren alleen de Uncaged vorm, en het epitoop overleeft fixatie goed ^11. Ten slotte kan gekooide fluoresceïne worden geactiveerd met een zeer hoge resolutie 3-D, in het bijzonder als twee-foton microscopie is ^12,13 gebruikt. Dit protocol beschrijft een methode van de lijn etikettering door gekooid fluoresceïne en laser uncaging. Subsequenctly, is Uncaged fluoresceïne tegelijk gedetecteerd met andere epitopen, zoals GFP door middel van etikettering met antilichamen.

Protocol

1. Synthese van Gekooide Fluoresceïne Dextran

1. Meet 3,5 tot 4 mg aminodextran en toe te voegen in de Invitrogen geleverde getinte buis met 1 mg CMNB-kooien fluoresceïne SE. In onze handen Deze ratio geeft een gemiddelde belasting van ~ 2,5 kleurstofmoleculen per dextran.
2. Voeg 500 ul van 0,1 M Na ₂ B ₄ O ₇ (natriumboraat) buffer aan de buis.
3. Cap en vortex gedurende 30 seconden om de aminodextran en gekooide fluoresceïne op te lossen.
4. Laat 's nachts te reageren op een vortex mixer.
5. Draai de onderste sluiting op een Zeba spin-kolom en draai de dop. Markeer een stip op de kolom met een viltstift. Plaats kolom in een 15-mL conische buis.
6. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 2 minuten met de stip naar het midden van de rotor. Gebruik kolom onmiddellijk na het verdichten.
7. Plaats verdicht kolom in een nieuwe 15-mL conische buis.
8. Pool reactiemengsel en transfer naar het centrum van de verdichte kolom hars bed. Plaats de dop.
9. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 2 minuten met de stip naar het midden van de rotor. Na de spin, zal het eluens en de top van de kolom ongeveer gelijk schaduw van geel van kleur.
10. Breng de gele eluens (~ 350 pi) naar een 1.5-mL microcentrifugebuis.
11. Lyophilize droog in een speedvac. Dek de speedvac met folie.
12. Resuspendeer de resulterende ~ 2-3 mg van lichtgeel schuim in het water tot een uiteindelijke concentratie van 1% w / v.
13. Bewaar deze oplossing bij -20 ° C in folie beklede buizen. Het is een goed idee om aliquot de dextran oplossing voor repetitieve vriesdooien te voorkomen.

2. Injectie van Gekooide Fluoresceine Dextraan Into zebravis embryo

1. Verdun 1% w / v voorraad gekooide fluoresceïne dextran 1:05 of 1:10 in 0,2 M KCl.
2. Injecteer 0,5 - 1.0nL van gekooide fluoresceïne oplossing in de dooier van de ene cel stadium embryo's met behulp van een druk injector. Eenmaal geïnjecteerd, moet klauwen van de embryo's worden bewaard in het donker bij 28,5 ° C om niet-specifieke uncaging te verminderen.
3. Handmatig verwijderen chorions uit embryo's.
4. Verdoven embryo's in 4% tricaïne.
5. Embryo's worden gemonteerd in 0,8% agarose in 35mmx10mm petrischaal, dan bedekt met ei water.
6. Equilibreren gesmolten agarose in 50 ° C verwarmen blok voor tenminste 15 minuten.
7. Met behulp van een glazen pipet, het opstellen van een embryo in een minimale hoeveelheid water en laat het in de agarose. Opmerking: Het is belangrijk om de buis van agarose koel in uw hand voor ongeveer 30 seconden voordat op de invoering van de embryo in de buis om te voorkomen dat het doden van het embryo.
8. Pipetteer het embryo uit de tube, samen met ongeveer 50μL van agarose en verwijder de inhoud op het midden van de petrischaal.
9. Snel oriënteren het embryo met behulp van een plastic draad met de cellen te Uncaged naar boven. Opmerking: De agarose met koele snel zo haastig met het oriënteren van de embryo. Embryo's kunnen beschadigd raken als gemanipuleerd na de agarose wordt stijf.
10. Laat de agarose volledig stollen (dit duurt een paar minuten) en de schotel twee derde deel met ei water met 4% en 0,003% tricaïne PTU te vullen.

3. Laser Uncaging van fluoresceïne Dextran

1. De microscoop wordt gebruikt voor uncaging moet een 40X water immersie objectief.
2. We maken gebruik van een Photonics Instrumenten laser met de 365 nm kleurstof cel en de 70% / 30% split dichroïsche spiegel.
3. Voorafgaand aan uncaging, moet de laser worden gemaakt parfocaal met de doelstelling en verzwakt aan de juiste kracht.
4. Te richten van de laser, plaats een spiegelend glas schuift onder de doelstelling en de focus van de doelstelling tot krassen in de dia zichtbaar zijn.
5. Stel de laser verzwakker totdat de laser kan een duidelijk zichtbaar kras in de spiegel met een enkele puls produceren.
6. Stel het doel richten op en neer. Als de laser kan een kras produceren wanneer het doel is onscherp, stel de laserfocus ¼ draai omhoog of omlaag. Herhaal dit tot de laser kan de spiegel alleen wanneer het doel is gericht krabben.
7. Plaats gemonteerd embryo onder de doelstelling en focus op het gebied dat moet worden Uncaged.
8. Om vrij maken, focus op een cel van rente en pols het 10-20 keer op 2-3 Hz.
9. Na uncaging, gratis het embryo met het schillen van agarose weg met pincet en brengen ze in het ei-water met 0,003% PTU. Laat embryo's ontwikkelen in een lichtdichte doos wanneer deze zijn verholpen.

4. Antilichaam etikettering en de opsporing van Uncaged Fluoresceïne Dextran

1. Fix embryo's bij Ab fixatief (4% paraformaldehyde, 0,3 mm CaCl _2, 8% sucrose, 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,3) voor twee tot vier uur bij kamertemperatuur (RT) of 's nachts (O / N) bij 4 ° C. Houden embryo's in een lichte strakke doos of folie gewikkeld buis voor alle etiketterings stappen.
2. Verwijder fixatief en te vervangen door 100% MeOH, laat gedurende 10 minuten bij RT, verwijder MeOH en vervangce met verse 100% MeOH.
3. Bewaren in MeOH bij -20 ° C gedurende ten minste 30 minuten. Opmerking: U kunt in MeOH opslaan voor maximaal twee weken voor epitopen beginnen te degraderen.
4. Hydrateren embryo's met 5 minuten wassen bij RT van 75% MeOH/1X fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (1X PBSTw) en vervolgens 50% MeOH/50% 1XPBTw, dan is 25% MeOH/75% 1X PBSTw.
5. Was drie keer voor 5 minuten in 1XPBSTw.
6. Als embryo's worden> 24 uur oud, permiabilize embryo's met 10 ug / ml proteinase K in 1XPBSTw. Permiabilization tijd is afhankelijk van het podium. Vijf minuten in proteinase K is voldoende als de embryo's zijn tussen 24 en 48 uur na bevruchting (HPF). Meer tijd kan nodig zijn als voor oudere larven. Re-fix in Ab fixeermiddel voor 20 minuten bij RT
7. Was vijf keer gedurende 5 minuten in 1XPBSTw bij RT.
8. Incubeer in blok-oplossing (1XPBS, 0,1% Triton X100, 10% schapen serum, 10% Bovine serum albumine, 1% dimethyl sulfoxide) gedurende 1-2 uur bij RT.
9. Verdunnen primaire antilichamen (anti-fluoresceïne plus antistoffen tegen cell-type-specifieke markers) in het blokkeren van oplossing.
10. Incubeer embryo O / N bij 4 ° C in een oplossing die primaire antilichamen.
11. Was vier keer voor 20 minuten in 1XPhosphate gebufferde zoutoplossing met 0,1% Triton X100 (PBSTx) bij RT.
12. Verdunnen fluorescent gelabelde secundaire antilichamen (meestal 1:300) in het blokkeren van oplossing.
13. Incubate O / N bij 4 ° C in oplossing die secundaire antilichamen.
14. Was vier keer voor 20 minuten in 1XPBSTx bij RT.
15. Duidelijke embryo's in 50% glycerol/50% 1XPBS gedurende ten minste twee uur bij RT, verwijder vervolgens glycerol / PBS mengsel en voeg 100% glycerol en laat het staan ​​O / N bij 4 ° C.

5. Representatieve resultaten:

Na immunokleuring, moet er een verrijkt gebied van kleuring in de cellen die waren Uncaged (Figure.1). Het is niet ongebruikelijk om een ​​relatief hoge signaal-ruisverhouding te zien in> 48 uur oud zebravis, als gevolg van spontane uncaging van de fluoresceïne.

Figuur 1. Lineage etikettering van zebravis pijnappelklier complex. Op 24 HPF, een deel van de voorste pijnappelklier Anlage, aangegeven door foxd3:. GFP expressie, was Uncaged met behulp van UV-laserpulsen A) Door 48hpf, een linkszijdige cluster van cellen, genaamd de parapineal (rode cirkel) is ontstaan ​​uit de Uncaged domein (witte cirkel). B) Uncaged fluoresceïne signaal wordt verrijkt in de parapineal (rode cirkel) en de pijnappelklier orgel (witte cirkel).

Discussion

Zoals beschreven, dit protocol voorziet in een relatief snelle lijn etikettering methode in zebravis, dat is gebouwd op de algemeen gebruikte technieken van micro-injectie, microscopie, en immunofluorescentie. Wij hebben geconstateerd dat laser uncaging naar de meest efficiënte en kosteneffectieve manier om fluoresceïne vrij maken in een gelokaliseerde mode te zijn. Deze methode kan worden gebruikt om lijn label met experimentele eindpunten zo laat 4 DPF. Echter, als cellen delen, de gekooide-fluoresceïne concentratie per cel daalt uiteindelijk voorbij detecteerbare niveaus. Daarnaast zijn er meldingen geweest van spontane, niet-specifieke uncaging van fluoresceïne in de zebravis larven ^11. Als zodanig, detectie van Uncaged fluoresceïne het meest effectief is in de vroege larvale stadium (48-72 HPF) of eerder.

Onze voorkeur uncaging methode is door het gebruik van een gepulste laser stikstof. Deze worden vaak gebruikt voor cel-ablaties experimenten en zijn voldoende nauwkeurig tot singe cellen of kleine groepen van cellen ^11-12 bevrijden. Kan echter uncaging ook mogelijk met een confocale microscoop, twee-foton confocale microscopen zijn gebruikt om zeer nauwkeurige uncaging ¹² te bereiken. Aan de andere kant van het spectrum, als nauwkeurigheid niet is vereist dan een laser is overbodig. Een epifluorescerende microscoop uitgerust met een DAPI filter set kan gebruikt worden om vrij maken door een klein gaatje ^11.

We hebben ontdekt dat de detectie van Uncaged fluoresceïne met behulp van een primair antilichaam en fluorescerende secundair antilichaam, dat uitzendt op een rode of ver-rood golflengte (bijv. Alexa 633) best past bij onze behoeften. Dit stelt ons in staat om onderscheid te maken Uncaged fluoresceïne van GFP uitgedrukt door een transgen (figuur 1).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
Aminodextran, 10kDa	Invitrogen	D1860
Zeba desalt spin columns	Pierce, Thermo Scientific	89889
goat anti-fluorescein antibody	Invitrogen	A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody	Invitrogen	A21082
35mmx10mm petri dishes	BD Biosciences	351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective	Leica Microsystems	DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System	Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Proteinase K	Roche Group	03115836991
Plastic thread	Any Supplier
Agarose	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
Vortexing mixer	VWR international	Vortex Genie 2
Pressure injector	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3