Etichettatura stirpe di cellule Zebrafish con laser Uncagable Fluoresceina Destrano

Summary

Questo protocollo delinea un modo per etichettare e tracciare il destino dei piccoli gruppi di cellule di embrioni di zebrafish con UV-uncaging della fluoresceina in gabbia, seguita da montare tutto immunomarcatura per amplificare il segnale proveniente dal fluoresceina Uncaged.

Abstract

Un problema centrale in biologia dello sviluppo è quello di dedurre l'origine della miriade di tipi di cellule presenti nei vertebrati che si presentano dai precursori indifferenziati. I ricercatori hanno utilizzato vari metodi di etichettatura lignaggio, come ad esempio l'etichettatura DII ¹ e pressione di iniezione di enzimi tracciabili ² per il destino della cellula accertare nelle fasi successive di sviluppo in sistemi modello. Le mappe destino primo pesce zebra (Danio rerio) sono state assemblate mediante iniezione iontoforetica di coloranti fluorescenti, come destrano rodamina, in celle singole in regioni discrete dell'embrione e tracciare il destino della cellula etichettata nel tempo ^3-5. Anche se efficaci, questi metodi sono tecnicamente impegnativi e richiedono attrezzature specializzate non si trovano comunemente nei laboratori di zebrafish. Recentemente, photoconvertable proteine ​​fluorescenti, come Eos e Kaede, che irreversibilmente passare da verde a fluorescenza rossa quando esposta alla luce ultravioletta, stiamo vedendo un maggior uso in zebrafish ^6-8. La chiarezza ottica dell'embrione pesce zebra e la relativa facilità della transgenesi hanno reso questi strumenti particolarmente interessanti per l'etichettatura di lignaggio e di osservare la migrazione delle cellule in vivo ^7. Nonostante la loro utilità, queste proteine ​​hanno alcuni svantaggi rispetto ai metodi lignaggio dye-mediata etichettatura. Il più importante è la difficoltà che abbiamo trovato per ottenere 3-D ad alta risoluzione durante fotoconversione di queste proteine. In questa luce, forse la migliore combinazione di risoluzione e facilità d'uso per l'etichettatura lignaggio in zebrafish si avvale della gabbia fluoresceina destrano, un colorante fluorescente che è associato a un gruppo di tempra, che maschera la sua fluorescenza ^9. Il colorante può essere "Uncaged" (uscito dal gruppo tempra) all'interno di una cella specifica usando la luce UV di una lampada laser o mercurio, consentendo la visualizzazione della sua fluorescenza o immunolocalizzazione. A differenza dei metodi iontoforesi, fluoresceina in gabbia possono essere iniettati con apparati di iniezione standard e Uncaged con un microscopio a epifluorescenza dotato di un foro stenopeico ^10. Inoltre, gli anticorpi contro la fluoresceina rilevare solo la forma Uncaged, e la fissazione epitopo sopravvive ben ^11. Infine, fluoresceina in gabbia può essere attivato con altissima risoluzione in 3-D, soprattutto se la microscopia a due fotoni è impiegata ^12,13. Questo protocollo descrive un metodo di etichettatura lignaggio di fluoresceina in gabbia e uncaging laser. Subsequenctly, Uncaged fluoresceina viene rilevato in contemporanea con altri epitopi come GFP, mediante l'etichettatura con gli anticorpi.

Protocol

1. Sintesi di Caged Fluoresceina Destrano

1. Misurare 3,5-4 mg di aminodextran e aggiungere nel Invitrogen fornito tubo colorato contenente 1 mg di CMNB-gabbia fluoresceina SE. Nelle nostre mani, questo rapporto dà un carico medio di circa 2,5 molecole di colorante per destrano.
2. Aggiungere 500 ml di 0,1 M Na ₂ B ₄ O ₇ tampone (borato di sodio) al tubo.
3. Cap e vortex per 30 secondi per sciogliere il aminodextran e fluoresceina in gabbia.
4. Lasciare reagire durante la notte su un miscelatore vortex.
5. Svitare la chiusura in basso su una colonna di spin Zeba e allentare il tappo. Segna un punto sulla colonna con un pennarello. Mettere in una colonna da 15 ml tubo conico.
6. Centrifugare a 1000 xg per 2 minuti con il punto di fronte al centro del rotore. Usa colonna immediatamente dopo la compattazione.
7. Luogo colonna compattato in un nuovo tubo da 15 ml conica.
8. Piscina miscela di reazione e trasferimento al centro del letto compattato resina colonna. Sostituire il tappo.
9. Centrifugare a 1000 xg per 2 minuti con il punto di fronte al centro del rotore. A seguito del conferimento, l'eluente e la parte superiore della colonna sarà quasi la stessa tonalità di colore giallo.
10. Trasferire il eluente giallo (~ 350 mL) a 1,5 mL provetta.
11. Liofilizzare a secco in un speedvac. Coprire il speedvac con un foglio.
12. Risospendere il conseguente ~ 2-3 mg di pallido schiuma gialla in acqua ad una concentrazione finale di 1% w / v.
13. Conservare questa soluzione a -20 ° C in un foglio coperto di tubi. E 'una buona idea per la soluzione di destrano aliquota per evitare ripetitivi congelamento-scongelamento.

2. L'iniezione di fluorescina Caged Destrano in embrioni Zebrafish

1. Diluire 1% w / v punto della gabbia fluoresceina destrano 1:05 o 1:10 in KCl 0,2 M.
2. Iniettare 0,5 - 1.0nL della soluzione di fluoresceina in gabbia nel tuorlo delle cellule di embrioni uno stadio con una pressione di iniezione. Una volta iniettato, frizioni degli embrioni devono essere conservati al buio a 28,5 ° C per ridurre non specifici uncaging.
3. Rimuovere manualmente chorions da embrioni.
4. Anestetizzare gli embrioni nel 4% tricaine.
5. Gli embrioni saranno montati nello 0,8% di agarosio in piatto 35mmx10mm Petri, poi coperta con acqua uovo.
6. Equilibrare fuso agarosio in 50 blocchi ° C Calore per almeno 15 minuti.
7. Utilizzando una pipetta di vetro, elaborare un embrione in una quantità minima di acqua e rilasciarla nella Nota di agarosio:. E 'importante per raffreddare il tubo di agarosio in mano per circa 30 secondi prima di mettere l'embrione nel tubo per evitare uccidendo l'embrione.
8. Pipetta l'embrione dal tubo, insieme a circa 50μL di agarosio ed espellere il contenuto sul centro della capsula di Petri.
9. Rapidamente orientare l'embrione utilizzando un filo di plastica con le celle da Uncaged rivolto verso l'alto. Nota: Il agarosio con raffreddare rapidamente in modo da essere precipitoso con orientare l'embrione. Gli embrioni possono essere danneggiati se manipolato dopo l'agarosio diventa rigida.
10. Lasciare che il agarosio solidificare completamente (l'operazione richiede pochi minuti) e riempire i due terzi piatto pieno di acqua uovo contenente 4% e 0,003% tricaine PTU.

3. Laser Uncaging di Fluoresceina Destrano

1. Il microscopio usato per uncaging deve avere un obiettivo 40X immersione in acqua.
2. Usiamo un Photonics strumenti laser con cella di 365 nm colorante e il 70% / 30% diviso specchio dicroico.
3. Prima uncaging, il laser deve essere fatta parafocale con l'obiettivo e attenuato alla potenza adeguata.
4. Per mettere a fuoco il laser, posto un vetrino specchio sotto l'obiettivo e mettere a fuoco l'obiettivo fino a graffi nella diapositiva sono visibili.
5. Regolare laser attenuatore fino a quando il laser in grado di produrre un graffio ben visibile nello specchio con un singolo impulso.
6. Regolare il fuoco dell'obiettivo su e giù. Se il laser in grado di produrre un graffio quando l'obiettivo è a fuoco, regolare il fuoco del laser a ¼ di giro verso l'alto o verso il basso. Ripetere fino a quando il laser può graffiare lo specchio solo quando l'obiettivo è a fuoco.
7. Luogo montato embrione nel quadro dell'obiettivo e mettere a fuoco l'area da Uncaged.
8. Per uncage, focus su una cella di interesse e di impulso è 10-20 volte a 2-3 Hz.
9. Dopo uncaging, libero il bimbo con peeling agarosio via con una pinza e di metterli in acqua uovo contenente 0,003% PTU. Lasciate che gli embrioni si sviluppano in un box a tenuta di luce fino a che non sono fissi.

4. Etichettatura e di rilevamento degli anticorpi di Uncaged Fluoresceina Destrano

1. Fissare gli embrioni in Ab fissativo (4% paraformaldeide, 0.3MM CaCl _2, 8% di saccarosio, fosfato 1X Soluzione salina tamponata, pH 7.3) per 2-4 ore a temperatura ambiente (RT) o di notte (O / N) a 4 ° C. Mantenere gli embrioni in una scatola di luce stretto o imballati in pellicola tubo per tutte le fasi di etichettatura.
2. Rimuovere fissativo e sostituire con il 100% MeOH, lasciare per 10 minuti a RT, rimuovere MeOH e sostituce fresca MeOH 100%.
3. Conservare in MeOH a -20 ° C per almeno 30 minuti. Nota: È possibile memorizzare in MeOH per un massimo di due settimane prima di epitopi cominciano a degradare.
4. Reidratare embrioni con 5 lavaggi minuto a RT del 75% fosfato MeOH/1X soluzione salina tamponata con 0,1% di Tween 20 (1X PBSTw), poi 1XPBTw 50% MeOH/50%, poi 25% MeOH/75% 1X PBSTw.
5. Lavare tre volte per 5 minuti in 1XPBSTw.
6. Se gli embrioni sono> 24 ore di vita, permiabilize embrioni con 10 mg / ml proteinasi K in 1XPBSTw. Tempo Permiabilization dipende sul palco. Cinque minuti in proteinasi K è sufficiente se gli embrioni sono tra 24 e 48 ore dopo la fecondazione (HPF). Più tempo può essere richiesto se per gli anziani larve. Ri-fix in Ab fissativo per 20 minuti a RT
7. Lavare cinque volte per 5 minuti in 1XPBSTw a temperatura ambiente.
8. Incubare in soluzione di blocco (1XPBS, x100 Triton 0,1%, 10% di siero di pecora, 10% di siero bovino albume, 1% Dimetilsolfossido) per 1-2 ore a temperatura ambiente.
9. Diluire gli anticorpi primari (anti-fluoresceina più anticorpi contro specifici marcatori di cellule-tipo) a bloccare soluzione.
10. Embrioni incubare O / N a 4 ° C in una soluzione contenente anticorpi primari.
11. Lavare quattro volte per 20 minuti in 1XPhosphate Soluzione salina tamponata con x100 Triton 0,1% (PBSTx) a temperatura ambiente.
12. Diluire fluorescenza marcata con anticorpi secondari (di solito 1:300) in soluzione di blocco.
13. Incubare O / N a 4 ° C in una soluzione contenente anticorpi secondari.
14. Lavare quattro volte per 20 minuti in 1XPBSTx a temperatura ambiente.
15. Embrioni in chiaro 1XPBS 50% glycerol/50% per almeno due ore a temperatura ambiente, quindi rimuovere glicerolo / PBS miscela e aggiungere 100% glicerolo e lasciate riposare O / N a 4 ° C.

5. Rappresentante dei risultati:

Dopo immunomarcatura, ci dovrebbe essere un'area arricchita di colorazione nelle cellule che sono state Uncaged (Figure.1). Non è raro vedere un segnale relativamente alto rapporto rumore> 48 zebrafish ora vecchi, a causa di uncaging spontanea della fluoresceina.

Figura 1. Etichettatura Lineage del complesso zebrafish pineale. A 24 HPF, una parte del anlage anteriore pineale, indicata da foxd3:. Espressione GFP, è stato Uncaged utilizzando impulsi laser UV A) Con 48hpf, un lato sinistro ammasso di cellule chiamato parapineal (cerchio rosso) è emerso dalla Uncaged dominio (cerchio bianco). B) Uncaged segnale fluoresceina è arricchito in parapineal (cerchio rosso) e l'organo pineale (cerchio bianco).

Discussion

Come descritto, questo protocollo fornisce un metodo relativamente rapido etichettatura lignaggio in zebrafish che si basa su delle tecniche comunemente usate di microiniezione, microscopia, ed immunofluorescenza. Abbiamo scoperto che il laser uncaging essere il modo più efficiente ed economica per uncage fluoresceina in maniera localizzata. Questo metodo potrebbe essere usato per etichettare lignaggio con endpoint sperimentale non più tardi di 4 dpf. Tuttavia, come le cellule si dividono, la gabbia-fluoresceina concentrazione per cella diminuisce alla fine oltre i livelli rilevabili. Inoltre, vi sono state segnalazioni di spontanea e non specifici uncaging di fluoresceina in larve zebrafish ^11. Come tale, l'individuazione di fluoresceina Uncaged è più efficace nei primi mesi stadio larvale (48-72 HPF) o versioni precedenti.

Il nostro metodo uncaging preferito è con l'uso di un laser pulsato di azoto. Questi sono comunemente usati per esperimenti sulle cellule ablazioni e sono sufficientemente accurato per uncage cellule singe o piccoli gruppi di cellule ^11-12. Tuttavia, uncaging può anche essere realizzato utilizzando un microscopio confocale a due fotoni microscopio confocale sono stati utilizzati per ottenere uncaging molto preciso ^12. All'altra estremità dello spettro, se la precisione non è necessaria allora una laser è superfluo. Un microscopio epifluorescente dotato di una serie DAPI filtro può essere usato per uncage attraverso un piccolo foro stenopeico ^11.

Abbiamo scoperto che il rilevamento della fluoresceina Uncaged utilizzando un anticorpo primario e secondario immunofluorescenza che emette alla lunghezza d'onda di colore rosso o rosso-lontano (per esempio Alexa 633) meglio si adatta alle nostre esigenze. Questo ci permette di distinguere fluoresceina Uncaged da GFP espressa da un transgene (Figura 1).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
Aminodextran, 10kDa	Invitrogen	D1860
Zeba desalt spin columns	Pierce, Thermo Scientific	89889
goat anti-fluorescein antibody	Invitrogen	A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody	Invitrogen	A21082
35mmx10mm petri dishes	BD Biosciences	351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective	Leica Microsystems	DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System	Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Proteinase K	Roche Group	03115836991
Plastic thread	Any Supplier
Agarose	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
Vortexing mixer	VWR international	Vortex Genie 2
Pressure injector	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3