レーザーUncagableフルオレセインデキストランでゼブラフィッシュ細胞の系統ラベリング

Summary

このプロトコルは、uncagedフルオレセインからの信号を増幅するために免疫標識全体のマウントが続くケージフルオレセインのUV -アンケージングを、使用してセルゼブラフィッシュ胚の小グループの運命にラベルを付けたり、トレースする方法を区別します。

Abstract

発生生物学の中心問題は、未分化前駆体から生じるとして、脊椎動物に存在する無数の細胞型の起源を推定することです。研究者は、DIIラベル¹とモデルシステムの開発の後期段階で把握細胞の運命にトレーサブルな酵素の圧力注入²のような系統の標識の様々な方法を採用している。ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）の最初の運命のマップは、胚の離散的な領域で単一の細胞に、そのようなローダミンデキストランとして、蛍光色素のイオン導入注入によって組み立てられ、時間^3-5を介して標識細胞の運命をトレースしていた。効果的な一方で、これらの方法は技術的に要求しており、また一般的にゼブラフィッシュラボでは見られない特殊な装置を必要としている。最近、紫外線にさらされると不可逆的に緑色から赤色蛍光への切り替えなどイーオスや楓などのphotoconvertable蛍光タンパク質は、、、ゼブラフィッシュ^6-8の使用の増加を見ている。ゼブラフィッシュ胚や遺伝子導入の相対的な容易さの光学的透明度は、系列ラベリングのためのこれらの特に魅力的なツールを作られているし、in vivoで⁷に細胞の移動を観察する。それらのユーティリティにもかかわらず、これらのタンパク質は、色素を介した系統の標識方法と比べて不利な点がいくつかある。最も重要な我々はこれらのタンパク質の光変換の間に高い3次元分解能を得るに見ている難しさです。この光の中で、おそらくゼブラフィッシュの系統の標識のための解像度と使いやすさの最適な組み合わせは、ケージフルオレセインデキストランの使用、消光グループにバインドされている蛍光色素になりますそのマスクの蛍光^9。染料は、その蛍光または免疫検出の可視化を可能にする、レーザーや水銀ランプからの紫外光を使用して特定のセル内（消光グループから解放さ）"uncaged"することができます。イオン導入の方法とは異なり、ケージフルオレセインは、標準的な注入装置を挿 ​​入することができ、ピンホール¹⁰を装備した蛍光顕微鏡でuncaged。さらに、フルオレセインに対する抗体だけuncagedフォームを検出し、エピトープは、固定も¹¹生き残っています。最後に、ケージフルオレセインは、2光子顕微鏡は^、12,13を採用している場合は特に、非常に高い3次元分解能をアクティブにすることができます。このプロトコルは、ケージフルオレセインとレーザーのアンケージングによって系統のラベリングの方法を説明します。 Subsequenctly、uncagedフルオレセイン抗体で標識することによりGFPなどの他のエピトープと同時に検出される。

Protocol

1。リテーナフルオレセインデキストランの合成

1. うち3.5測定 - アミノデキストランの4 mgをしCMNB -ケージフルオレセインSEの1mgを含有するInvitrogen社が提供する着色チューブに加える。私たちの手でこの比率は、デキストランあたり〜2.5色素分子の平均的な負荷を与えます。
2. チューブに0.1 MのNa ₂ B ₄ O _7（ホウ酸ナトリウム）バッファーを500μLを加える。
3. デキストランとケージフルオレセインを溶解するために30秒間のキャップと渦。
4. ボルテックスミキサーで一晩反応してみましょう。
5. Zebaスピンカラムの底部の閉鎖をねじり切るとキャップを緩めます。フェルトペンでカラム上のドットをマーク。 15 mLコニカルチューブの場所の列。
6. ローターの中心が直面している点で2分間1,000 × gで遠心する。圧縮後すぐにカラムを使用してください。
7. 新しい15 mLコニカルチューブに圧縮列を置きます。
8. プールの反応混合物と圧縮カラムの樹脂床の中心に移転。キャップを交換してください。
9. ローターの中心が直面している点で2分間1,000 × gで遠心する。スピンした後、溶離液とカラムの上部には、色の黄色のほぼ同じ色合いになります。
10. 1.5 mLのマイクロ遠心チューブに黄色の溶離液（〜350μL）を転送する。
11. speedvacに乾燥するまで凍結乾燥。箔とspeedvacをカバーしています。
12. その結果、再サスペンド〜水中の1％の最終濃度w / vのに淡黄色泡状の2-3ミリグラム
13. 箔で覆われたチューブ内で-20℃でこのソリューションを保管してください。それはアリコートに、繰り返し凍結融解を防ぐためにデキストラン溶液は良い考えです。

2。ゼブラフィッシュ胚に入りフルオレセインデキストランの注入

1. 0.2MのKClでケージフルオレセインデキストラン1：05または1:10の1％（w / v）の株式を希釈する。
2. 0.5注入 - ケージフルオレセイン溶液の1.0nLを圧力注入器を使用して1細胞期胚の卵黄に。一度注入、胚のクラッチは、° Cの非特異的アンケージングを減らすために28.5で暗所に保管する必要があります。
3. 手動で胚からchorionsを削除します。
4. 4パーセントtricaineの胚を麻酔。
5. 胚はその後、卵の水で覆われ、35mmx10mmのペトリ皿に0.8％アガロースでマウントされます。
6. 少なくとも15分間50℃のヒートブロックにアガロースを融解平衡化させます。
7. ガラスピペットを用いて、水の最小量の内の1つの胚を策定し、アガロースノートにそれを解放します。それは前に避けるために、チューブ内に胚を置くことに約30秒間手の中でアガロースのチューブを冷却することが重要です。胚を殺す。
8. 約50μLアガロースのと一緒に、チューブから胚をピペットとペトリ皿の中央に内容を取り出します。
9. すぐに面が上になるように向きuncagedする細胞とプラスチックのスレッドを使用して、胚注：クールとアガロースは、速やかに胚を配向させると性急である。アガロースがリジッドになった後に操作した場合の胚が損傷することができます。
10. アガロースが完全に固化（これは数分かかります）、4％tricaineと0.003％のPTUを含む卵を水で完全に皿3分の2を埋めることができます。

3。フルオレセインデキストランのレーザーアンケージング

1. アンケージングのために使用される顕微鏡は40倍の水浸対物レンズを持っている必要があります。
2. 我々は365nmの色素細胞と70％/ 30％のスプリットダイクロイックミラーで光計測器レーザーを使用してください。
3. アンケージングする前に、レーザーは、客観的かつ適切な電力の減衰と同焦点にしなければならない。
4. レーザーを当てるために、客観的で、ミラー化されたスライドガラスを配置し、スライドの傷が見えるようになるまで目標を置いています。
5. レーザーは単一パルスとミラーではっきりと目に見える傷を作り出すことができるまで、レーザー減衰器を調整します。
6. 客観的なフォーカスを調整し、ダウン。目標の焦点が合っていないときにレーザーの傷を作ることができれば、レーザーの焦点を調整¼上下に回すか。目的がフォーカスされているときのみレーザーがミラーをスクラッチできるようになるまで繰り返します。
7. 場所はuncagedする領域上で客観的かつ焦点の下胚をマウント。
8. 鳥かごから出すために、目的の細胞に焦点を当て、2〜3 Hzでそれを10〜20倍のパルスを与える。
9. 鉗子で離れてアガロースを剥離し、0.003％のPTUを含む卵の水でそれらを置くことによって、胚アンケージング後、フリー。それらが修復されるまで、胚は遮光ボックスで開発しましょう​​。

4。 Uncagedフルオレセインデキストランの抗体ラベリングと検出

1. 抗体固定液に胚を修正4℃、室温（RT）または一晩（O / N）で2〜4時間℃で（4％パラホルムアルデヒドを、0.3mmのCaCl _2で 、8％のショ糖を、1Xのリン酸緩衝生理食塩水、pHが7.3バッファ）光タイトボックスまたはすべてのラベリングのステップのためのアルミホイルに包まれたチューブに胚を保持。
2. 固定液を除去し、100％MeOHで置き換え、室温で10分間放置し、MeOHとreplumの複数形を削除する新鮮な100％のMeOHでCE。
3. 少なくとも30分間、-20℃でメタノールのストア注：。エピトープが低下し始める前に、最大2週間までMeOHに格納することができます。
4. 75パーセントMeOH/1Xリン酸塩の室温で5分間洗浄した胚を再水和するが0.1％のTween 20（1X PBSTw）と緩衝生理食塩水、次いで50％MeOH/50％の1XPBTw、、25％MeOH/75％1X PBSTw。
5. 1XPBSTwで5分間3回洗浄する。
6. 胚は、> 24時間経過した場合、10μgの/ 1XPBSTw mLのプロテイナーゼKで胚をpermiabilize。 Permiabilization時間は、ステージに依存しています。胚は、24および48時間後に受精（HPF）の間にある場合プロテイナーゼKで5分で十分です。より多くの時間は、古い幼虫の場合必要になることがあります。室温で20分間抗体固定液で再修正
7. 室温で1XPBSTwで5分間5回洗浄する。
8. 室温で1-2時間（1XPBS、0.1％トリトンX100、10％ヒツジ血清、10％ウシ血清アルブミン、1％ジメチルスルホキシド）ブロックの溶液中でインキュベートする。
9. ブロッキング溶液に一次抗体（抗フルオレセインを加えた細胞型特異的マーカーに対する抗体）を希釈する。
10. 4℃でインキュベート胚O / N °一次抗体を含む溶液中でC。
11. 1XPhosphateで20分間4回洗浄すると、室温で0.1％トリトンX100（PBSTx）と緩衝生理食塩水。
12. ブロッキング溶液で蛍光標識二次抗体を（通常は1:300）に希釈する。
13. 4℃でインキュベートするO / N °二次抗体を含む溶液中でC。
14. RTで1XPBSTxで20分間4回洗浄。
15. 室温で少なくとも2時間は50％glycerol/50％の1XPBSの明確な胚は、その後、グリセロール/ PBSの混合物を削除し、100％のグリセロールを追加し、4℃でO / Nを放置℃を

5。代表的な結果：

免疫標識した後、（Figure.1）uncagedされた細胞で染色の豊かな領域があるはずです。それはフルオレセインの自発アンケージングによる、> 48時間古いゼブラフィッシュで雑音比に比較的高い信号を見ることも珍しくありません。

ゼブラフィッシュ松果体複合体の図1。リネージュラベリング。 24でHPF、foxd3で示される前松果体原基の一部、：。GFPの発現は、紫外レーザーパルスを用いてuncagedした）48hpfすることにより、セルの左サイドクラスタがparapinealと呼ばれる（赤い丸）uncagedから浮上しているドメイン（白丸）。B）Uncagedフルオレセインの信号がparapineal（赤い円に富んでいる）と松果体（白丸）。

Discussion

説明したように、このプロトコルは、マイクロインジェクション、顕微鏡、および免疫蛍光の一般的に使用される技術に基づいて構築されているゼブラフィッシュでは比較的速い系統の標識法を提供する。我々は、レーザーは、ローカライズされた形でフルオレセインを刑務所から出すために最も効率的かつコスト効果の高い方法であることがアンケージングことを発見した。このメソッドは、4 DPFとして後半に実験的なエンドポイントとの系統のラベルに使用することができる。しかし、細胞が分裂と、細胞あたりのケージ-フルオレセイン濃度は、最終的に検出可能なレベルを超えて減少する。さらに、ゼブラフィッシュの幼虫¹¹のフルオレセインの自発的、非特異的アンケージングの報告されている。このように、uncagedフルオレセインの検出は、初期の幼生期（48〜72 HPF）またはそれ以前で最も効果的です。

私達の好まれたアンケージングの方法は、パルス窒素レーザーを使用することです。これらは一般に細胞のアブレーションの実験のために使用され、単独のセルまたはセル^{11から12まで}の小グループを刑務所から出すために十分に正確ですされています。しかし、アンケージングも共焦点顕微鏡を用いて達成することができる、二光子共焦点顕微鏡は、非常に正確なアンケージング^12を達成するために使用されています。精度が要求されていない場合、スペクトルのもう一方の端に、その後レーザーがする不要です。 DAPIフィルターセットを装備した落射蛍光顕微鏡は、小さなピンホール¹¹を介して刑務所から出すために使用することができます。

私たちは、一次抗体と赤または遠赤色波長（例えば、アレクサ633）に最適な我々のニーズに発光する蛍光二次抗体を使用してuncagedフルオレセインのその検出を発見した。これにより、導入遺伝子（図1）で表されるGFPからuncagedフルオレセインを区別することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
Aminodextran, 10kDa	Invitrogen	D1860
Zeba desalt spin columns	Pierce, Thermo Scientific	89889
goat anti-fluorescein antibody	Invitrogen	A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody	Invitrogen	A21082
35mmx10mm petri dishes	BD Biosciences	351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective	Leica Microsystems	DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System	Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Proteinase K	Roche Group	03115836991
Plastic thread	Any Supplier
Agarose	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
Vortexing mixer	VWR international	Vortex Genie 2
Pressure injector	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3