Rotulagem de linhagem de células Zebrafish com Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Summary

Este protocolo delineia uma forma de rótulo e traçar o destino de pequenos grupos de células de embriões zebrafish utilizando UV-uncaging de fluoresceína enjaulado, seguido por montar todo imunomarcação para amplificar o sinal da fluoresceína uncaged.

Abstract

Um problema central na biologia do desenvolvimento é deduzir a origem da miríade de tipos de células presentes nos vertebrados que possam surgir a partir de precursores indiferenciados. Pesquisadores têm utilizado diversos métodos de rotulagem linhagem, como DII rotulagem ¹ e injeção de pressão de enzimas rastreáveis ^​​2 para verificar o destino de células em fases posteriores de desenvolvimento em sistemas-modelo. Os mapas destino primeiro peixe-zebra (Danio rerio) foram montados por meio de injeção de iontoforese de corantes fluorescentes, tais como a rodamina dextran, em células isoladas em regiões discretas do embrião e rastreamento destino da célula marcada ao longo do tempo ^3-5. Apesar de eficaz, estes métodos são tecnicamente exigentes e que requerem equipamento especializado não comumente encontrados em laboratórios de zebrafish. Recentemente, photoconvertable proteínas fluorescentes, como o Eos e Kaede, que irreversivelmente mudar de verde para vermelho quando fluorescência expostos à luz ultravioleta, estamos vendo maior utilização em zebrafish ^6-8. A claridade óptica do embrião zebrafish ea relativa facilidade de transgênese têm feito essas ferramentas particularmente atraente para a rotulagem de linhagem e de observar a migração das células in vivo ^7. Apesar de sua utilidade, essas proteínas têm algumas desvantagens em comparação com corante mediada métodos de rotulagem linhagem. Crucial a maioria é a dificuldade que temos encontrado na obtenção de resolução em 3-D de alta durante fotoconversão destas proteínas. A esta luz, talvez a melhor combinação de resolução e facilidade de uso para a rotulagem linhagem em zebrafish faz uso de gaiolas de fluoresceína dextran, um corante fluorescente que é vinculado a um grupo de têmpera que mascara seus ⁹ de fluorescência. O corante pode ser "uncaged" (lançado a partir do grupo quenching) dentro de uma célula específica usando a luz UV de uma lâmpada a laser ou mercúrio, permitindo a visualização de sua fluorescência ou imunodetecção. Ao contrário dos métodos de iontoforese, fluoresceína enjaulado pode ser injetado com aparelhos de injeção padrão e uncaged com um microscópio de epifluorescência equipado com uma pinhole ^10. Além disso, anticorpos contra fluoresceína detectar apenas a forma uncaged, eo epítopo sobrevive bem fixação ^11. Finalmente, fluoresceína enjaulado pode ser ativada com muito alta resolução 3-D, especialmente se a microscopia de dois fótons é empregada ^12,13. Este protocolo descreve um método de rotulagem linhagem de fluoresceína enjaulado e uncaging laser. Subsequenctly, uncaged fluoresceína é detectado simultaneamente com outros epitopos, como GFP pela marcação com anticorpos.

Protocol

1. Síntese do Caged Fluorescein Dextran

1. Meça 3,5-4 mg de aminodextran e adicione dentro do tubo Invitrogen fornecidos matizado contendo 1 mg de fluoresceína CMNB gaiolas SE. Em nossas mãos esta relação dá uma carga média de ~ 2,5 moléculas de corante por dextran.
2. Adicionar 500 mL de 0,1 M ₂ B Na ₄ tampão O ₇ (borato de sódio) para o tubo.
3. Cap e vortex por 30 segundos para dissolver o aminodextran e fluoresceína enjaulado.
4. Vamos reagir durante a noite em um misturador de vórtice.
5. Retire a parte inferior de fechamento em uma coluna de spin Zeba e soltar a tampa. Marcar um ponto na coluna com uma caneta de feltro. Coloque em uma coluna de tubo de 15 mL cônico.
6. Centrifugar a 1000 xg por 2 min com o ponto de frente para o centro do rotor. Use coluna imediatamente após a compactação.
7. Colocar a coluna compactada em um tubo de 15 mL nova cônico.
8. Mistura piscina reação e transferência para o centro da cama compactado coluna de resina. Recoloque a tampa.
9. Centrifugar a 1000 xg por 2 min com o ponto de frente para o centro do rotor. Após a rodada, o eluente eo topo da coluna será mais ou menos o mesmo tom de cor amarela.
10. Transferir o eluente amarelo (~ mL 350) a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
11. Lyophilize à secura em um speedvac. Cobrir o speedvac com papel alumínio.
12. Re-suspender a ~ 2-3 mg resultantes de espuma amarelada na água para uma concentração final de 1% w / v.
13. Conservar a solução a -20 ° C em folhas cobertas de tubos. É uma boa idéia para a solução de dextran alíquota para evitar congelamento e descongelamento repetitivos.

2. A injeção de fluoresceína Caged Dextran em embriões Zebrafish

1. Diluir 1% de ações w / v de fluoresceína enjaulado dextran 1:05 ou 1:10 em KCl 0,2 M.
2. Injetar 0,5 - 1.0nL de solução de fluoresceína enjaulado na gema de uma célula de embriões palco usando uma pressão injector. Uma vez injetadas, embreagens de embriões devem ser mantidos no escuro a 28,5 ° C para reduzir a não-específica uncaging.
3. Remover manualmente córions a partir de embriões.
4. Anestesiar embriões em tricaina 4%.
5. Embriões serão montados em agarose 0,8% em 35mmx10mm placa de Petri, em seguida, cobertos com água de ovo.
6. Equilibrar agarose derretida em 50 bloco de aquecimento ° C por pelo menos 15 minutos.
7. Usando uma pipeta de vidro, elaborar um embrião em uma quantidade mínima de água e colocá-la no Nota agarose:. É importante para resfriar o tubo de agarose em sua mão por aproximadamente 30 segundos antes de colocar o embrião para dentro do tubo para evitar matar o embrião.
8. Pipetar o embrião do tubo, juntamente com cerca de 50μL de agarose e ejetar o conteúdo para o centro da placa de Petri.
9. Orientar rapidamente o embrião usando um fio de plástico com as células a serem uncaged voltada para cima. Nota: A agarose com frio rapidamente para ser apressada com a orientação do embrião. Embriões podem ser danificadas se manipulada após a agarose torna-se rígida.
10. Permitir que a agarose para solidificar completamente (este processo leva alguns minutos) e encher o prato dois terços cheio com água contendo ovos tricaina 4% e 0,003% PTU.

3. Laser Uncaging de fluoresceína Dextran

1. O microscópio utilizado para uncaging deve ter uma objetiva de imersão 40X água.
2. Nós usamos um Photonics Instruments laser com a célula de 365 nm corante e os 70% / 30% dividido espelho dicróico.
3. Antes de uncaging, o laser deve ser feita com o objetivo parfocal e atenuada com a potência adequada.
4. Para focar o laser, coloque uma lâmina de vidro espelhado com o objetivo e foco o objetivo até arranhões no slide são visíveis.
5. Ajustar a laser atenuador até que o laser pode produzir um risco claramente visível no espelho com um único pulso.
6. Ajuste o foco objetivo cima e para baixo. Se o laser pode produzir um risco quando o objetivo é fora de foco, ajustar o foco do laser ¼ de volta para cima ou para baixo. Repita até que o laser pode riscar apenas quando o objetivo é focada.
7. Lugar montado embrião no âmbito do objectivo e focar a área a ser uncaged.
8. Para soltar da jaula, o foco em uma célula de interesse e de pulso que 10-20 vezes menos 2-3 Hz.
9. Depois uncaging, embrião do livre por raspagem agarose afastado com uma pinça e colocá-los em água contendo ovos PTU 0,003%. Deixe os embriões se desenvolvem em uma caixa à prova de luz até que sejam corrigidos.

4. Rotulagem de anticorpos e Detecção de Fluoresceína Uncaged Dextran

1. Fix embriões em Ab fixadora (paraformaldeído 4%, 0,3 CaCl _2, 8% de sacarose, fosfato de 1X tampão pH, solução salina 7,3) por 2-4 horas à temperatura ambiente (RT) ou durante a noite (O / N) a 4 ° C. Manter os embriões em uma caixa de luz apertado ou embrulhado em papel alumínio do tubo para todas as etapas rotulagem.
2. Remover fixador e substituir com MeOH 100%, deixe por 10 minutos a RT, remova e substitua MeOHce com MeOH 100% fresco.
3. Loja em MeOH a -20 ° C durante pelo menos 30 minutos. Nota: Você pode armazenar em MeOH por até duas semanas antes de começar a degradar epitopos.
4. Reidratar embriões com 5 lavagens minuto a RT de 75% de fosfato MeOH/1X solução salina tamponada com 0,1% Tween 20 (1X PBSTw), então 1XPBTw 50% MeOH/50%, então 25% MeOH/75% 1X PBSTw.
5. Lavar três vezes por 5 minutos em 1XPBSTw.
6. Se os embriões são> 24 horas de idade, permiabilize embriões com 10 mcg / mL proteinase K em 1XPBSTw. Permiabilization tempo é dependente no palco. Cinco minutos em proteinase K é suficiente se os embriões são entre 24 e 48 horas pós-fertilização (hpf). Mais tempo pode ser necessária se para mais larvas. Re-fix em Ab fixadora por 20 minutos a RT
7. Lavar cinco vezes por 5 minutos em 1XPBSTw na RT.
8. Incubar em solução de bloco (1XPBS, Triton x100 0,1%, 10% de soro de ovelha, 10% de soro bovino albumina, 1% Dimetil sulfóxido) por 1-2 horas em temperatura ambiente.
9. Diluir anticorpos primários (anti-fluoresceína mais anticorpos contra células do tipo marcadores específicos) em solução de bloqueio.
10. Embriões incubar S / N, 4 ° C em solução contendo anticorpos primários.
11. Lavar quatro vezes por 20 minutos em 1XPhosphate Buffered Saline com Triton x100 0,1% (PBSTx) em temperatura ambiente.
12. Diluir fluorescente marcado com anticorpos secundários (geralmente 1:300) em solução de bloqueio.
13. Incubar S / N, 4 ° C em solução contendo anticorpos secundários.
14. Lavar quatro vezes por 20 minutos em 1XPBSTx na RT.
15. Embriões claro em 50% 1XPBS glycerol/50% para pelo menos duas horas em temperatura ambiente, em seguida, remover o glicerol / PBS mistura e adicione glicerol 100% e deixe descansar O / N a 4 ° C.

5. Resultados representativos:

Depois de imunomarcação, deve haver uma área enriquecida de coloração nas células que foram uncaged (Figura.1). Não é incomum ver um sinal relativamente alta-ruído em> zebrafish 48 horas de idade, devido a uncaging espontânea da fluoresceína.

Figura 1. Lineage rotulagem de zebrafish complexo pineal. Aos 24 hpf, uma parte do primórdio anterior pineal, indicado por foxd3:. Expressão GFP, foi uncaged utilizando pulsos de laser UV A) Ao 48hpf, um cluster do lado esquerdo de células chamado de parapineal (círculo vermelho) surgiu a partir da uncaged domínio (círculo branco). B) sinal de fluoresceína Uncaged é enriquecido no círculo (parapineal vermelho) e do órgão pineal (círculo branco).

Discussion

Como descrito, este protocolo fornece um método de rotulagem relativamente rápido linhagem em zebrafish que é construída sobre as técnicas comumente usadas de microinjeção, microscopia e de imunofluorescência. Nós descobrimos que o laser uncaging ser a forma mais eficiente e de custo eficaz para libertar da gaiola de fluoresceína de uma forma localizada. Este método poderia ser usado para rotular linhagem com pontos de extremidade experimental tão tarde como 4 dpf. No entanto, como as células se dividem, a concentração de fluoresceína-enjaulado por célula, eventualmente, diminui para além dos níveis detectáveis. Além disso, tem havido relatos de espontâneo, uncaging não-específica de fluoresceína em peixes-zebra larvas ^11. Como a detecção, como de fluoresceína uncaged é mais eficaz na fase larval precoce (48-72 hpf) ou anterior.

Nosso método uncaging preferido é pelo uso de um laser pulsado de nitrogênio. Esses são comumente usados ​​para experimentos ablações célula e são suficientemente precisas para soltar da jaula singe células ou pequenos grupos de células ^11-12. No entanto, uncaging também pode ser realizada utilizando um microscópio confocal; dois fótons microscópios confocal têm sido usados ​​para conseguir uncaging muito precisos ^12. Na outra extremidade do espectro, se a precisão não é necessária, então um laser é dispensável. Um microscópio de epifluorescência equipado com um conjunto de filtros DAPI pode ser usado para libertar da gaiola através de um furo pequeno ^11.

Nós descobrimos que a detecção de fluoresceína uncaged utilizando um anticorpo primário e anticorpo secundário fluorescente que emite no comprimento de onda vermelho ou vermelho-distante (por exemplo, Alexa 633) melhor se adapte às nossas necessidades. Isto permite-nos distinguir fluoresceína uncaged da GFP expressa por um transgene (Figura 1).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
Aminodextran, 10kDa	Invitrogen	D1860
Zeba desalt spin columns	Pierce, Thermo Scientific	89889
goat anti-fluorescein antibody	Invitrogen	A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody	Invitrogen	A21082
35mmx10mm petri dishes	BD Biosciences	351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective	Leica Microsystems	DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System	Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Proteinase K	Roche Group	03115836991
Plastic thread	Any Supplier
Agarose	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
Vortexing mixer	VWR international	Vortex Genie 2
Pressure injector	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3