Summary
Un romanzo impulsivo esperimento pressurizzazione cella è stato sviluppato utilizzando un dispositivo bar Kolsky di investigare i meccanismi molecolari / cellulari di blast-indotta lesione cerebrale traumatica.
Abstract
Un romanzo impulsivo esperimento pressurizzazione cella è stato sviluppato utilizzando un dispositivo bar Kolsky per indagare esplosione indotta da lesione traumatica cerebrale (TBI). Dimostriamo in questo articolo video come perfetto TBI-rilevante pressurizzazione impulsivo viene applicata alle cellule neuronali in vitro. Questo è ottenuto utilizzando ben controllati impulso di pressione creata da un dispositivo specializzato Kolsky bar, con la storia completa pressione all'interno della camera di pressurizzazione cella registrata. Pressurizzati cellule neuronali sono controllati immediatamente dopo la pressurizzazione, o ulteriormente incubato per esaminare a lungo termine effetti di pressurizzazione impulsivo su neurite / assonale conseguenza, l'espressione genica neuronale, apoptosi, ecc abbiamo osservato che la pressurizzazione impulsivo a circa 2 MPa induce distinta relativa perdita dei neuriti alle cellule non pressurizzate. La nostra tecnica prevede un nuovo metodo per studiare i meccanismi molecolari / cellulari di esplosione TBI, con pressurizzazione impulsivo delle cellule cerebrali a ben controllati prEssure ampiezza e la durata.
Protocol
1. Coltura cellulare neuronale
- Cellule del cervello, comprese cellule neuronali, astrociti, e la loro co-coltura può essere utilizzato come modello cellulare. A dimostrazione di fattibilità, pressurizzazione impulsivo delle cellule neuronali linea cellulare viene presentato.
- SH-SY5Y cellule di neuroblastoma umano (ATCC, CRL-2266) sono coltivate su 18 coprioggetto mm di vetro di diametro. Le cellule vengono seminate ad una densità di 3 x 10 3 cellule / cm 2 mediante i mezzi di crescita composto DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina. Vetrini cellule coltivate vengono conservati in 5% CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C.
- Per ottenere la differenziazione neuronale delle cellule SH-SY5Y, le cellule vengono trattate con supporti ulteriormente integrato con 10 mM di acido retinoico (RA) per 7 giorni con supporti cambiati ogni due giorni. Il giorno 7, le cellule sono pronte per essere in pressione.
2. Pressurizzazione Attrezzatura: Kolsky Bar
- Il bar Kolsky, desviluppata da Kolsky 1 nel 1949, è stato utilizzato per misurare le proprietà meccaniche di un materiale ad un tasso di carico molto elevata. L'apparecchiatura consiste di due barre con un campione posto in contatto tra le barre. Un onda d'urto, creata sulla barra incidente, propaga al campione in cui l'onda si divide in un'onda riflessa e trasmessa. Lo stress nel campione è proporzionale alla onda trasmessa. In questo studio, si utilizzano una camera di pressurizzazione cella da interporre tra le due barre del Kolsky set-up.
- Le due barre di lega di alluminio (ogni 6-m) sono sospese da bronzine allineati, e una camera di pressurizzazione in vitro di cellule è inserita tra le barre. Il bar a monte è la barra incidente con una massa di 130 £ fissato su una delle estremità. Un morsetto di attrito è collocato in una posizione che darà la durata di impulso desiderata. Impegnando il morsetto e il serraggio di un jack forbice tra la massa ed un supporto di carico, il morsetto-massa sezione della barra incidente è pre-compressed al livello desiderato. Costringendo un bullone dentata che blocca il morsetto di una rottura improvvisa di un sistema idraulico rilascia la compressione pre-memorizzati rapidamente e genera così un impulso di pressione. Questo si propaga attraverso la barra incidente, spinge il pistone camera di prova, e pressurizza il fluido e le cellule all'interno della camera impulsivamente. La camera di pressurizzazione a sua volta emette un impulso di pressione di moltiplicazione nei bar a valle trasmessi. I ceppi associati con gli impulsi di pressione nelle barre sono misurate con manometri ad alta resistenza estensimetri composti eccitati a 45 volt. I segnali di gauge sono registrate con un oscilloscopio digitale a 1 MHz come una storia di carico.
- La camera di pressurizzazione in vitro di cellule è composto da un cilindro-pistone. Il cilindro ha diametro interno 2,6 cm e 3,8 cm di diametro esterno, e ha un piccolo foro filettato alla base della cavità. Il foro funge da sfiato aria e liquidi in eccesso durante l'installazione cella campione. Il pistone è 7,5 cm di lunghezzaed è realizzato in materiale stessa barra. Il pistone è avvolto con due o tre strati di idraulico (Teflon) del nastro che fungono da guarnizione a basso attrito. La testata è di 32 mm di lunghezza e dispone di due piccole viti in acciaio inox che fissano i vetrini (in cui le cellule sono coltivate) durante il caricamento.
3. Pressurizzazione impulsivo delle cellule neuronali
- Tutte le parti della camera di pressurizzazione sono sterilizzati usando l'autoclave e sono tenuti sotto luce UV. L'assemblaggio della camera viene eseguito all'interno della cappa coltura cellulare. La vite di sfiato della camera è liberamente impegnata nella presa d'aria alla base della cavità. Pre-riscaldata (37 ° C), mezzi di crescita freschi pipettato nella camera senza fare bolle. Quindi, una cellula-coltura vetrino viene raccolto, ed è posto sul tappo del pistone (cellule rivolti all'esterno). Le piccole viti che tengono sono serrati verso il basso sulla diapositiva per tenerlo in posizione. Il pistone con una cellula-coltura vetrino viene inserito un poco into della cavità della camera, e il gruppo è inclinato con lo sfiato essendo nel punto più alto. La vite di sfiato viene rimosso e il pistone viene spinto nella prima cavità costringendo le bolle d'aria, il liquido in eccesso. Un segno di riferimento o una maschera viene utilizzato come guida per garantire lo stesso volume di cultura media per ogni test. La dimensione assiale del supporto della camera è di circa 6 mm. Disinfettare la vite di sfiato e sostituirlo per rendere l'acqua camera di tenuta. La camera non dovesse perdere in questa carico statico, se lo fa, la pellicola Teflon deve essere sostituito o rinforzato.
- A questo punto, il sistema bar Kolsky è resettato. La massa pesante viene spostato nella posizione originale e un bullone di bloccaggio sostituisce l'usato (rotto) uno. Inserire la nuova vite di bloccaggio con l'idraulica a circa 200 psi. Utilizzare il jack forbici per comprimere il pre-caricamento sezione della barra incidente fino ad una pressione di poco superiore al valore desiderato, e poi marcia indietro per innestare la frizione pienavite di Jack. L'acquisizione dei dati è ora in funzione.
- L'assemblato camera di pressurizzazione cella è montata nel sistema. Esso è collocato in un blocco V supportato da laboratorio piccola forbice jack e allineato con le due barre. Ingrassare ogni interfaccia con uno strato di grasso leggero e strofinare le superfici intestatura insieme per eliminare eventuali vuoti d'aria tra i due.
- Il test è ora pronto per procedere. Il bullone di bloccaggio pinza è costretto a rompere in fretta pompando il driver idraulico pinza. Il morsetto separerà e l'acquisizione dei dati deve visualizzare i risultati. La storia pressurizzazione cella è determinato dalle misurazioni del calibro bar trasmesso. Se la barra di trasmissione utilizzato è abbastanza lungo, questa dovrebbe essere solo dal primo disturbo al punto in cui le misurazioni mostrano una pressione negativa. La durata dell'impulso trasmesso può essere più breve impulso incidente se una bolla viene intrappolato. L'entità non può raggiungere quella dell'impulso incidente, ma dovrebbe avere una sufficiente long pianoro prima dello scarico. Altrimenti, sia una bolla d'aria grande nella camera stagna o un disallineamento tra il gruppo e un bar potrebbe essersi verificato.
- La camera di pressurizzazione cella viene quindi rimosso e smontato all'interno della cappa coltura cellulare. La vite di sfiato viene rimosso e il pistone viene tirato libera della camera. La cellula-coltura vetrino viene prelevato dalla testa del pistone.
4. La valutazione del comportamento sotto pressione cellulare
- Dopo la pressurizzazione, le cellule possono essere ispezionati immediatamente o ulteriormente incubate per successivo esame. Con adeguati processi di funzionamento asettici, a più lungo termine post-incubazione è possibile.
- Cellule in pressione può essere esaminato da tutte le tecniche di biologia molecolare e cellulare. In particolare per la pressurizzazione delle cellule neuronali, per studiare la fisiologia cellulare e molecolare in condizioni TBI, saggi di valutazione di pressione indotti cambiamenti nella crescita dei neuriti, il cambiamento dei microtubuli del citoscheletro, expre gene neuronalession, apoptosi, ecc, possono essere eseguite. Come campioni di cellule di controllo, cellule che sono coltivate stesso, mantenuto all'interno della camera di pressurizzazione per lo stesso periodo, ma non in pressione vengono utilizzati (cosiddetta, camera di controllo).
- Per valutare i cambiamenti nella crescita dei neuriti, cellule di controllo pressione e la camera sono esaminati al microscopio ottico subito dopo la pressurizzazione e il 1 ° e 24 ore di post-incubazione. Un esempio di immagini di cellule neuronali sono riportati nella sezione "Rappresentante dei risultati" (Figura 2). La variazione di lunghezza dei neuriti può essere quantificato mediante colorazione immunofluorescente actina e analisi d'immagine. Cellule vengono fissate con 4% w / v soluzione di paraformaldeide, sciacquato con 0,05% v / v Tween-20 tampone di lavaggio, e permeabilizzate con v / v 0,1% Triton X-100 soluzione. Dopo il bloccaggio con un 1% w / v di albumina sierica bovina, le cellule vengono incubate con tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC)-coniugato falloidina. Immagini immunofluorescenza delle cellule sono effettuate utilizzando un fluorescentemicroscopio e le lunghezze dei neuriti di cellule pressione e controllo vengono quantificati utilizzando il software ImageJ (NIH).
- I neuriti possono essere identificati come assoni o dendriti. Per valutare le variazioni morfologiche assoni o dendriti, gli esperimenti descritti sopra possono essere ripetute utilizzando anticorpi specifici ciascuna struttura, cioè, neurofilamenti (NF) anticorpo per assoni e proteina associata ai microtubuli (MAP2) anticorpali per dendriti.
- Microtubuli sono uno dei componenti chiave citoscheletrici di neuroni, e il danno ai microtubuli è stato usato come marcatore di danno neuronale. 2 microtubuli possono essere visualizzati utilizzando il immunofluorescently β-tubulina. Cellule vengono fissate dopo 0 e 24 h post-pressurizzazione, colorati con β-tubulina, e osservato al microscopio a fluorescenza.
- Per valutare l'effetto di pressurizzazione impulsivo sull'espressione genica neuronale apoptotica, RNA totale viene estratto da cellule pressione e controllo. Genespressione e può essere esaminato eseguendo quantitativa RT-PCR o real-time RT-PCR, simile ai nostri protocolli pubblicati. 3
5. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Un esempio di profilo di pressione applicata alle cellule all'interno della camera di pressurizzazione. L'apparato bar Kolsky genera successo 2 livello MPa, singolo impulso pressurizzazione tipo impulsivo con una durata di circa 0,7 ms.
Figura 2. Un esempio di risposta cellulare neuronale della pressurizzazione impulsivo. SH-SY5Y esposte a pressurizzazione impulsivo a 2 MPa mostra distinta neurite / assone rottura rispetto a cellule di controllo della camera.
6. Difficoltà e soluzioni
- Camera di tenuta è uno dei principali ostacoli da superare. È found che i dischi di grandi dimensioni con o-ring hanno un problema di scriccatura e maggiore attrito. Al fine di eliminare gli effetti di attrito, così come impedire sgorbiatura, un semplice metodo di nastratura pistone idraulico con nastro di teflon viene utilizzato. Questo risolve i problemi e produce livello di pressione desiderato e durata.
- Sotto pressione il comportamento delle cellule neuronali, in particolare in sede di valutazione secondaria meccanismo di trauma cranico o di effetti a lungo termine, devono essere esaminati dopo un lungo tempo di post-incubazione. La cella contenente camera è esposta a potenziali condizioni non sterili mentre si sposta al bar Kolsky, pressurizzazione, e tornando alla cappa coltura cellulare. Con pre-sterilizzazione dei pezzi da camera e il funzionamento corretto per il montaggio / smontaggio della cellula-colta vetrino e la camera all'interno della cappa di coltura cellulare, a più lungo termine post-incubazione è possibile fino a diverse settimane.
- La riproducibilità dei dati è un parametro importante per cellulari esperimenti di stimolazione meccanica. Per il nostro dispositivo, il reproducibility in risposta neuronale è determinato come desiderato profilo impulsivo pressurizzazione, sia sul livello di pressione e durata, si ottiene ripetutamente. Dal registriamo il profilo di pressione ottenuti per ogni pressurizzazione, i dati di risposta delle celle di profilo di pressione indesiderato può essere escluso manualmente in seguito.
- Le fasi di pressurizzazione intero, compreso l'assemblaggio della camera, il trasferimento e montare nella barra Kolsky, pressurizzazione, il trasferimento-back, e la camera di smontaggio, in meno di 10 minuti. La slitta cella successiva coltivate può essere pressurizzata immediatamente dopo la pressurizzazione precedente. Così, il numero sufficiente di esperimenti di pressurizzazione può essere completato in modo efficiente. Il nostro set-up utilizza 18 millimetri di diametro coprioggetto. Un esperimento pressurizzazione non fornisce sufficienti proteine per Western immunoblotting causa delle dimensioni del substrato (e in parte anche perché alcune delle cellule pressurizzati sono morti). Circa tre esperimenti di pressurizzazione ripetuti fornire quantità di proteine necessaria per immunoblOtting. Ancora, la riproducibilità viene controllato ogni volta con il profilo di pressione.
Discussion
Molti in vitro tecniche sperimentali sono stati tentati per lo studio delle cellule danno cerebrale in condizioni TBI. Tra questi neuroni / astrociti stretching, il flusso indotto shear stress, calo di peso, lacerazione stilo, laser transezione, litotripsia, ecc 4,5 E 'stato ipotizzato che la breve durata sovrapressione è un fattore dominante fisica per trauma cranico. 6,7 Specialmente , l'onda d'urto dell'esplosione TBI ha una durata di impulso di un ordine di millisecondi. 4 Sulla base di questa ipotesi ed osservazione, camera barometro capace di pressurizzazione transitoria è stato sviluppato e utilizzato per valutare il comportamento delle cellule cerebrali in condizioni TBI. Per esempio, nella camera di fluido percussioni barotrauma un impulso di pressione con 20-30 ms lunga durata ed una pressione di picco fino a 0,5 MPa stato utilizzato per esaminare il comportamento umano cellule gliali sotto TBI. 6 Recentemente, VandeVord et al. 7 metallo usato palla camera barometro colpisce di esaminare la cella astrociticomportamento sotto TBI ma la sfera di metallo che colpisce prodotti impulsi di pressione più. In questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo dispositivo di pressurizzazione cella che genera un solo impulso di pressurizzazione tipo impulsivo. Il dispositivo è stato sviluppato in base barra Kolsky set-up, che è stato usato come materiale di un apparato di test nei nostri 8 e di altri studi. 1,9 La barra Kolsky di funzionalità di test materiale a regime di carico molto elevato è stato modificato per essere in grado di applicare impulso singolo sovrapressione tipo alle cellule coltivate all'interno della camera di pressurizzazione (Figura 1). Potremmo controllare con successo l'ampiezza e la durata della sovrapressione impulsivo. Come una risposta cellulare rappresentante, abbiamo dimostrato che a 2 MPa cellule neuronali SH-SY5Y visualizzare neurite significativa e perdita assonale rispetto alle cellule non pressurizzate camera di controllo.
In conclusione, abbiamo sviluppato un nuovo apparato di pressurizzazione impulsivo cella utilizzando un apposito Kolskydispositivo di bar e dimostrato il suo potenziale utilizzo nelle indagini risposta neuronale delle cellule in condizioni TBI. Abbiamo anche notare che questa tecnica è molto versatile in qualsiasi tipo di cellule può essere esposto a pressioni impulsive a vari livelli e la durata. Pertanto, il dispositivo può essere utilizzato per studiare l'impulsivo pressione indotta comportamento cellulare meccanotrasduzione, non solo per ferire le cellule ma anche per stimolare le cellule positivamente nella loro funzione e determinazione fato.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare le fonti di finanziamento: Esercito-UNL Centro per la Meccanica Trauma (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr. Namas Chandra), Premio Layman UNL (-001 26-1110-0033 , PI: Lim).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) human neuroblastoma cells | |||
| 18 mm diameter glass coverslips | |||
| Cell culture media: DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin | |||
| Retinoic acid (10 μM) for inducing neurogenesis | |||
| Kolsky bar impulsive pressurization device | |||
| Piston-cylinder cell pressurization chamber | |||
| Stainless steel screws for securing cell cultured coverslip on the piston | |||
| Grease for interfaces between cell chamber and Kolsky bar | |||
| General molecular biology supplies for assessing cell response to pressurization (fixative, antibody, fluorescent dye, PCR supplies, etc.) |
References
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