Summary
Une procédure de liquides à base de culture et de la distribution de
Abstract
Criblage à haut débit (HTS) est une approche puissante pour identifier des modulateurs chimiques des processus biologiques. Toutefois, de nombreux composés identifiés dans les écrans en utilisant des modèles de culture cellulaire sont souvent considérés comme toxiques ou pharmacologiquement inactive in vivo 1-2. Dépistage dans les modèles animaux entiers peuvent aider à éviter ces écueils et de rationaliser la voie du développement de médicaments.
C. elegans est un organisme modèle multicellulaire bien adapté pour HTS. Il est de petite taille (<1 mm) et peut être économiquement cultivé et distribué dans les liquides. C. elegans est également l'un des modèles animaux les plus dociles expérimentale permettant une identification rapide et détaillée de la drogue mode d'action 3.
Nous décrivons un protocole pour la culture et la distribution des souches fluorescentes de C. elegans pour criblage à haut débit de chimiothèques ou la détection de contaminants environnementaux qui modifient l'expression d'un gène spécifique. Un grand nombre de vers de développement synchronisé sont cultivées en milieu liquide, récoltées, lavées, et suspendu à une densité définie. Worms sont ensuite ajoutés au noir, fond plat, plaques 384 puits en utilisant un distributeur péristaltique liquide. Les petites molécules à partir d'une bibliothèque chimique ou échantillons de test (par exemple, eau, nourriture, ou le sol) peuvent être ajoutés aux puits avec des vers. In vivo, en temps réel l'intensité de fluorescence est mesurée avec un lecteur de microplaques à fluorescence. Cette méthode peut être adapté à n'importe quel gène inductible en C. elegans pour lequel un journaliste convenable est disponible. Beaucoup de stress inductible et de développement des voies de transcription sont bien définis dans C. elegans et les souches transgéniques GFP journaliste existent déjà pour beaucoup d'entre eux 4. Lorsqu'il est combiné avec les journalistes appropriée transgéniques, notre méthode peut être utilisée pour dépister les modulateurs voie ou à développer de solides analyses biocapteur pour les contaminants environnementaux.
Nous démontrons notre C. elegans culture et de distribution de protocole avec un test HTS nous avons développé pour surveiller le C. 'n' elegans bouchon facteur de transcription cols SKN-1. SKN-1 et son homologue de Nrf2 activer des gènes de mammifères cytoprotecteur durant le stress oxydatif et des xénobiotiques 5-10. Nrf2 protège les mammifères de nombreuses liée à l'âge des troubles tels que le cancer, la neurodégénérescence, et de l'inflammation chronique et est devenue une cible majeure chimiothérapeutiques 11-13. Notre analyse est basée sur une GFP journaliste transgéniques pour le SKN-1 gène cible -4 TPS 14, codant pour une glutathion-S 6 transférase. La TPS est également journaliste de -4 un biocapteur pour les produits chimiques xénobiotiques et oxydatif qui activent SKN-1 et peut être utilisé pour détecter de faibles niveaux de contaminants tels que l'acrylamide et le méthyl-mercure, 15-16.
Protocol
1. Préparation de la nourriture vers bactérienne
Jour 1
- Ajouter 5 ml d'eau saturée E. coli OP50 bouillon de culture bactérienne ml à 500 Terrific complété avec 50 pg / ml de streptomycine et de grandir dans un incubateur agitateur (225 rpm) pendant la nuit à 37 ° C.
Jour 2
- Séparer la culture de la nuit bactérienne en dix tubes de 50 ml et les bactéries par centrifugation dans une centrifugeuse réfrigérée à 2.500 rcf pendant 20 minutes.
- Décanter bouillon LB et resuspendre chaque culot bactérien dans 10 ml de liquide milieux de croissance des nématodes (NGM). Secouer horizontalement dans un shaker de plancher pendant 15 minutes pour remettre en suspension les bactéries. Pour faire tampon NGM, ajouter 3 g de NaCl à 1 L d'eau déminéralisée et autoclave. Laisser refroidir à 55 ° C et ajouter dans l'ordre les solutions suivantes stérile: 1 ml de 1 M CaCl 2, 1 ml de 1 M MgSO 4, et 25 ml de phosphate de potassium 1 M, pH 6,0.
- Centrifuger la culture bactérienne dans une centrifugeuse réfrigérée à 2.500 rcf pendant 20 minutes.
- Décanter tampon NGM et peser le culot bactérien.
- Ajouter un volume égal de tampon NGM pour remettre les boulettes, partie aliquote de 3 ml de bactéries se concentrer dans des tubes de 15 ml et conserver à -20 ° C.
2. À grande échelle C. elegans culture liquide
Nous utilisons une lignée transgénique VP596 (dvIs19 [pAF15 (TPS-4:: GFP:: SNA)]; vsIs33 [dop-3: DP]) transportant deux constructions fluorescentes: Pgst -4:: GFP 14 pour surveiller SKN-1 activité et PDOP-3: DP 17 pour servir de standard pour la normalisation des numéros ver.
Jour 1
- Mélanger 150 ml de tampon NGM, 1,5 ml de bouillon LB, 150 pi de 5 mg / ml de cholestérol (dans l'éthanol), et 75 ul de 100 mg / ml de streptomycine. Filtre-stériliser le mélange et ajouter à un ballon de 1 litre stérile.
REMARQUE: l'ajout de bouillon LB 1% de tampon NGM aide à prévenir les vers de coller à verre et en plastique, mais ce montant n'est pas suffisant pour soutenir la croissance des bactéries. - Synchroniser les vers à la procédure standard de l'hypochlorite de 18 ans. Jusqu'à 0,5 ml de vers gravides peuvent être traitées dans un seul tube de 15 ml avec 5 ml de solution d'hypochlorite (3,75 ml d'eau stérile, 1 ml de javel, et 250 pi NaOH 10 N). Lavez les oeufs libérés à l'eau stérile et les remettre en suspension dans 10 ml de tampon NGM.
- Diluez un échantillon d'œufs 100 fois NGM tampon (par exemple, 100 ul dans 10 ml) et de compter le nombre d'oeufs séparés en trois aliquotes de 5 pi. Multiples, le nombre moyen de 200.000 (100 x facteur de dilution 2000) pour estimer le nombre total d'œufs.
- Ajouter 200 000 à 2 millions d'œufs à la fiole avec un tampon de NGM et secouer la culture à 100 rpm, à 20 ° C.
Jour 2
- Au moins 16 h après l'ajout d'oeufs dans le ballon, utiliser une pipette stérile sérologique pour enlever environ 0,5 ml de la culture ver suspendu. Pipeter 5 gouttes trois ul sur le couvercle stérile d'une boîte de Pétri. Placez le couvercle dans un congélateur à -20 ° C pendant 1-2 minutes pour paralyser les vers. Comptez le nombre moyen de vers vivants éclos par 5 ul puis plusieurs par 30 000 (150 ml / 5 pl) pour estimer le nombre total de vers éclos.
- Dégeler un tube de gelée OP50 culture bactérienne (protocole 1.6) et ajouter 3 ml de 50% dans la culture OP50 ver par 500 000 vers éclos. Agiter le flacon à 100 rpm à 20 ° C. Worms se développer en larves L4 et les jeunes adultes dans environ 51 heures. La DO600 de bactéries devrait être d'environ 2.200 au début. Surveiller la quantité de bactéries par absorption et d'ajouter de plus si la DO 600 tombe en dessous de 0,900.
3. La collecte et la distribution de Worm
Jour 4
- Utiliser une pipette stérile sérologique au transfert d'environ 0,5 ml de la culture ver suspendu à une plaque de gélose NGM standard. Afficher les vers avec un stéréomicroscope pour s'assurer que la plupart sont des larves L4 ou de jeunes adultes. Larves L4 aura un spot ventrale claire dans le milieu du corps. Les jeunes adultes seront légèrement plus grand et ne sera pas une tache claire.
- Verser la culture ver dans des tubes de 50 ml stériles et placer les tubes dans un portoir sur la paillasse. Autoriser les vers de se contenter de 10 minutes environ. Eliminer le surnageant par aspiration ou pipetage.
REMARQUE: Cette étape peut être important d'enlever les œufs non éclos ou des vers qui ne se développent pas car ils se déposent plus lentement que les larves L4 et les jeunes adultes. - Ramassez tous les vers dans un seul tube de 50 ml et laver avec un tampon de NGM avec du bouillon LB 1% (NGM + LB) 3-4 fois pour éliminer les bactéries.
NOTE: Ceci est fait de mieux dans une centrifugeuse en collectant des vers à 500 fcr pendant 30 sec et en remplaçant le surnageant avec le NGM frais + tampon LB. - Après le lavage, remplir le tube avec le NGM + tampon LB à 50 ml et versez dans un flacon à vis sans fin personnalisée de distribution. Ajouter un barreau de petites et remuer pour garder les vers suspendu. Comptez èmee nombre de vers en trois 5 gouttes ul comme indiqué plus haut. Diluer avec le NGM + LB jusqu'à ce que vous obtenez 12 à 15 vers par 5 ul baisse (de 2.5 à 3.0 ~ vers / ul).
REMARQUE: Un minimum d'environ 20 ml (60.000 vers) est nécessaire pour combler l'espace mort du flacon de distribution et d'une cassette distributeur. Chaque plaque 384 puits nécessite environ 35 000 vers ou 11,5 ml de vers suspendu. - Chargez une cassette de 10 ul de distribution et stériliser par amorçage avec de l'éthanol à 70%. Rincer l'éthanol par amorçage à l'eau stérile.
- Insérez l'extrémité de la cassette de distribution dans le ballon de sorte qu'il est juste au-dessus de la barre remuez sans perturber son mouvement. Assurez-vous que les vers restent en suspension dans le flacon entier. Programme du distributeur de se passer à basse vitesse avec 2 pré-impulsions. Premier et exécuter au moins 10 ml de vers suspendu. Remplissez plaques comme nécessaire rapidement pour empêcher les vers de s'installer dans le tube.
- Sceller les plaques avec du ruban adhésif respirant.
- Placez les plaques sur une table d'agitation dans un incubateur à la température appropriée pour votre analyse. Ne pas empiler les assiettes.
4. L'analyse par fluorescence
- Placer la plaque cible dans un lecteur de microplaques pour mesurer l'intensité de fluorescence de chaque puits avec la longueur d'onde appropriée d'émission et d'excitation (Filtres pour notre analyse: la GFP 485/20ex 528/20em; DP 540/25ex 590/35em).
- Calculer le rapport de la GFP / RFP et normaliser les lectures des puits témoin (sans composé activant) pour déterminer la différence exacte pli de l'intensité de fluorescence provenant des traitements individuels.
5. Les résultats représentatifs:
Notre SKN-1 essai utilise une souche journaliste de chromosomes double intégrée (VP596). Comme le montre la figure 1, le nombre de vers est bien corrélé au volume distribué. Comme le montrent les figures 2A et 2B, le total des GFP et DP de fluorescence par puits est hautement reproductible d'un puits à travers une plaque de 384 puits. Comme le montre la figure 2C, l'ONU-induite Pgst-4:: fluorescence de la GFP est linéairement corrélée à PDOP-3: DP dans 384 puits. Lorsqu'il est exprimé comme un rapport de la GFP / RFP, la fluorescence devient hautement reproductibles d'un puits à travers une plaque de 384 puits (comparer le coefficient de variation de la figure 2D pour 2A) démontrant la capacité de la PDOP-3:: Un journaliste demande de propositions pour réduire la variabilité. Comme le montre la figure 3, l'induction de la GFP relatives à la DP avec un SKN-1 activation des xénobiotiques (38 juglone uM) est robuste et hautement reproductible à travers une plaque de 384 puits.
Figure 1. Nombre de vers en fonction du volume distribué. Worms ont été dilués à environ 2/μl et distribués dans une plaque à 24 puits pour le comptage manuel avec un stéréomicroscope. N = 8 puits par volume.
Figure 2. Fluorescence totale de vers distribuée dans une plaque 384 puits est reproductible. Worms ont été dilués à environ ul 2.5/μl et 30 a été distribué dans chaque puits d'une plaque de 384 puits. GFP (A) et DP (B) de fluorescence de tous les puits ont un coefficient de variation inférieur à 9%. (C) fluorescence de la GFP est fortement corrélé à la DP fluorescence. (D) Calcul du ratio de la GFP à la DP a réduit le coefficient de variation au-dessous de 6% (A, B et D) Les lignes pleines indiquent les moyens et les lignes brisées indiquent trois déviations standard au-dessus ou en dessous de la moyenne.
. Figure 3 Activation de Pgst-4:: GFP est robuste et cohérente. Environ 75 L4 vers ont été distribués dans tous les puits d'une plaque de 384 puits et 38 uM juglone a été ajouté dans chaque colonne. GFP et DP fluorescence a été mesurée après 21 h d'incubation. La relative moyenne des ratios de fluorescence de tout contrôle (1,0) et la juglone puits (8,9) sont marqués par des lignes pleines. Trois déviations standard au-dessus du contrôle de la moyenne et inférieure à la moyenne juglone sont marqués par des lignes brisées.
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Discussion
Nous présentons une méthode pour la culture et la distribution de grands nombres de nématodes transgéniques. L'équipement utilisé pour les vers de la culture est la norme pour les laboratoires effectuant le clonage moléculaire et la manipulation de liquides et de l'équipement de fluorescence est standard pour les laboratoires de traitement de grands nombres de microplaques. D'autres méthodes de distribution grand nombre de vivre C. elegans nécessitent des particules onéreux équipement de tri 19. Le Pgst-4: dosage de la GFP peut être utilisé pour dépister les modulateurs à petites molécules de facteurs «n» de la PAC de transcription collier et pour détecter les contaminants xénobiotiques et oxydant dans les échantillons environnementaux et alimentaires 14,16. Robuste inductible transgéniques GFP journalistes sont disponibles pour un large éventail de sentiers et de stimuli environnementaux 4, et donc notre méthode devrait être applicable à des modulateurs en développement de nombreuses voies et de détecter un large spectre de contaminants.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
C. elegans transgènes ont été fournis par le Centre de Génétique Caenorhabditis (Université du Minnesota, Minneapolis, MN). Ce travail a été soutenu par le NIH R21 octroi NS0667678-01 à KS. Tous les auteurs ont participé à la collecte, l'analyse et l'interprétation des données. CKL, KS, et KPC participé à la rédaction et la révision du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled(352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nalge Nunc international | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone)Juglone | Acros Organics | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
References
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