उच्च throughput और प्रतिदीप्त के साथ स्क्रीनिंग biosensing सी. एलिगेंस खींच

Summary

तरल आधारित संवर्धन और वितरण के लिए एक प्रक्रिया

Protocol

1. बैक्टीरियल कीड़ा भोजन की तैयारी

दिवस 1

1. संतृप्त ई. के 5 मिलीलीटर जोड़ें कोलाई OP50 जीवाणु संस्कृति को 500 मिलीलीटर बहुत खूब शोरबा 50 स्ट्रेप्टोमाइसिन / μg मिलीलीटर के साथ पूरक है और 37 पर एक मिलाते हुए (225 आरपीएम) इनक्यूबेटर रातोंरात में बढ़ने डिग्री सेल्सियस

2 दिन

2. दस 50 मिलीलीटर और ट्यूबों एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में अपकेंद्रित्र बैक्टीरिया में 20 मिनट के लिए 2,500 आरसीएफ पर रातोंरात जीवाणु संस्कृति भाजित.
3. लेग शोरबा बंद छानना और तरल निमेटोड विकास मीडिया (एन जी एम) के 10 मिलीलीटर में प्रत्येक जीवाणु गोली resuspend. एक मंजिल प्रकार के बरतन में क्षैतिज 15 से बैक्टीरिया resuspend मिनट के लिए हिलाओ. एन जी एम बफर बनाने के लिए, 1 एल विआयनीकृत पानी और आटोक्लेव 3 जी NaCl जोड़ने. 55 से कूल ° सी और आदेश में निम्नलिखित बाँझ समाधान जोड़ने के लिए: एम 1 ₂ CaCl, 1 एम MgSO ₄ के 1 मिलीलीटर, और 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 6.0 के 25 मिलीलीटर की एक मिलीलीटर.
4. 20 मिनट के लिए 2,500 आरसीएफ पर एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में जीवाणु संस्कृति अपकेंद्रित्र.
5. एन जी एम बफर बंद छानना और बैक्टीरियल गोली तौलना.
6. छर्रों, जीवाणुओं की 3 मिलीलीटर विभाज्य -20 में 15 मिलीलीटर ट्यूबों, और दुकान में ध्यान केंद्रित डिग्री सेल्सियस resuspend एन जी एम बफर के एक बराबर मात्रा में जोड़ें

2. बड़े पैमाने पर सी. एलिगेंस तरल संस्कृति

हम एक ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग VP596 (dvIs19 [(GST 4 pAF15: GFP: NLS)]; vsIs33 [DOP 3: आरएफपी]) ले जाने के दो फ्लोरोसेंट constructs: Pgst -4: ¹⁴ GFP SKN-1 की निगरानी गतिविधि और Pdop-3: ¹⁷ आरएफपी कीड़ा संख्या सामान्य के लिए एक मानक के रूप में सेवा करने के लिए.

दिवस 1

1. मिक्स 150 मिलीलीटर एन जी एम बफर, 1.5 मिलीलीटर लेग शोरबा, 5 कोलेस्ट्रॉल मिलीग्राम / एमएल के 150 μl (इथेनॉल), और 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन के 75 μl. मिश्रण फ़िल्टर बाँझ और 1 लीटर बाँझ फ्लास्क जोड़ें.
   नोट: एन जी एम बफर 1% लेग शोरबा जोड़ने के लिए कांच के बने पदार्थ और plasticware के लिए चिपके से कीड़े को रोकने में मदद करता है, लेकिन इस राशि बैक्टीरिया विकास का समर्थन करने के लिए पर्याप्त नहीं है.
2. कीड़े मानक हाइपोक्लोराइट ¹⁸ प्रक्रिया के साथ सिंक्रनाइज़ करें . Gravid कीड़े के 0.5 मिलीलीटर hypochlorite समाधान के 5 मिलीलीटर (3.75 मिलीलीटर बाँझ पानी, 1 मिलीलीटर घरेलू ब्लीच, और 250 μl 10 एन NaOH) के साथ एक एकल 15 मिलीलीटर ट्यूब में संसाधित किया जा सकता है. बाँझ पानी के साथ धो जारी अंडे और उन्हें एन जी एम बफर के 10 मिलीलीटर में resuspend.
3. एन जी एम बफर में 100 गुना (उदाहरण के लिए, 10 मिलीलीटर में 100 μl) अंडे का एक नमूना पतला और तीन अलग - अलग 5 μl aliquots में अंडे की संख्या गिनती. एकाधिक दो लाख (100 कमजोर पड़ने कारक +२,००० x) द्वारा औसत संख्या अंडे की कुल संख्या का अनुमान करने के लिए.
4. एन जी एम बफर के साथ फ्लास्क में 200.000 करने के लिए 2 लाख अंडे जोड़ें और 100 rpm पर 20 बजे संस्कृति हिला डिग्री सेल्सियस

2 दिन

5. कम से कम 16 घंटे के फ्लास्क अंडे जोड़ने के बाद, एक बाँझ सीरम वैज्ञानिक pipet का उपयोग करने के लिए लगभग निलंबित कीड़ा संस्कृति के 0.5 मिलीलीटर हटायें. Pipet 5 बाँझ ढक्कन पर एक पेट्री डिश के तीन μl बूँदें. एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 1-2 के कीड़े को पंगु बना मिनट के लिए ढक्कन प्लेस. 5 और फिर तीस हज़ार (150 / 5 मिलीलीटर μl) द्वारा μl एकाधिक प्रति रहते रची कीड़े की औसत संख्या की गणना करने के लिए रची कीड़े की कुल संख्या का अनुमान है.
6. पहले गला लें जमी OP50 जीवाणु संस्कृति (1.6 प्रोटोकॉल) की एक ट्यूब और कीड़ा संस्कृति में 500.000 रची कीड़े प्रति 50 OP50% 3 मिलीलीटर जोड़ने. 100 rpm पर 20 फ्लास्क हिलाएँ डिग्री सेल्सियस कीड़े L4 के बारे में 51 घंटों में लार्वा युवा वयस्कों में विकसित होगा. शुरुआत में जीवाणुओं की OD600 2.200 के बारे में होना चाहिए. Absorbance के द्वारा जीवाणुओं की मात्रा मॉनिटर और अधिक जोड़ने अगर आयुध डिपो 600 नीचे 0.900 बूँदें.

3. इल्ली संग्रह और वितरण

4 दिन

1. एक बाँझ सीरम वैज्ञानिक pipet का उपयोग करने के लिए एक मानक एन जी एम अगर प्लेट निलंबित कीड़ा संस्कृति का लगभग 0.5 मिलीलीटर हस्तांतरण. को यकीन है कि ज्यादातर L4 लार्वा या युवा वयस्कों हैं stereomicroscope के साथ कीड़े देखें. L4 लार्वा शरीर के बीच में उदर स्पष्ट हाजिर होगा. युवा वयस्कों थोड़ा बड़ा है और एक स्पष्ट जगह है नहीं होगा किया जाएगा.
2. बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूबों में कीड़ा संस्कृति डालो और benchtop पर एक टेस्ट ट्यूब रैक में ट्यूबों की जगह. कीड़े के बारे में 10 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें. आकांक्षा या pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें.
   नोट: यह कदम महत्वपूर्ण हो unhatched अंडे या कीड़े कि विकसित नहीं किया हटाने क्योंकि वे L4 धीमी गति से लार्वा और युवा वयस्कों के आदी हो जाएगा कर सकते हैं.
3. एक एकल 50 मिलीलीटर और 1% पौंड (एन जी एम + पौंड) शोरबा 3-4 बार बैक्टीरिया को दूर करने के साथ एन जी एम बफर के साथ ट्यूब धोने में सभी कीड़े को ले लीजिए.
   नोट: यह सबसे अच्छा 30 सेकंड के लिए 500 आरसीएफ में कीड़े और एकत्रित ताजा एन जी एम + लेग बफर के साथ सतह पर तैरनेवाला की जगह द्वारा किया जाता है एक अपकेंद्रित्र झूल बाल्टी में है.
4. धोने के बाद, एन जी एम के साथ ट्यूब भरने + 50 मिलीलीटर लेग बफर और एक कस्टम कीड़ा वितरण फ्लास्क में डालना. एक छोटी सी हलचल बार जोड़ें और हलचल कीड़े निलंबित रखने. वें गणनाकीड़े के तीन 5 μl बूंदों में ई संख्या के रूप में उपर्युक्त. एन जी एम + लेग के साथ पतला जब तक आप 5 μl ड्रॉप (~~ 2.5-3.0 कीड़े / μl) के अनुसार 12-15 कीड़े मिलता है.
   नोट: वितरण फ्लास्क और दवासाज़ कैसेट मृत स्थान को भरने के बारे में 20 मिलीलीटर (60,000 कीड़े) की एक न्यूनतम करने के लिए की जरूरत है. प्रत्येक 384 अच्छी तरह से थाली के बारे में 35,000 कीड़े या निलंबित कीड़े के 11.5 मिलीलीटर की आवश्यकता है.
5. एक 10 μl वितरण कैसेट लोड और 70% इथेनॉल के साथ भड़काना द्वारा बाँझ. बाँझ पानी के साथ भड़काना द्वारा इथेनॉल कुल्ला.
6. फ्लास्क में वितरण कैसेट के अंत सम्मिलित करना इतना है कि यह सिर्फ अपने आंदोलन में खलल न डालें बिना हलचल पट्टी के ऊपर है. सुनिश्चित करें कि कीड़े पूरे कुप्पी भर निलंबित रहते हैं. कार्यक्रम दवासाज़ कम गति पर दो - पूर्व दालों के साथ बांटना. प्रधानमंत्री और निलंबित कीड़े के कम से कम 10 मिलीलीटर चलाते हैं. के रूप में तेजी से जरूरत टयूबिंग में बसने से कीड़े को रोकने के प्लेटें भरें.
7. सांस टेप के साथ प्लेटें सील.
8. अपनी परख के लिए उचित तापमान पर एक इनक्यूबेटर में मिलाते मंच पर प्लेटें प्लेस. प्लेटें ढेर मत करो.

4. प्रतिदीप्ति विश्लेषण

1. एक microplate रीडर में लक्ष्य की थाली प्लेस उपयुक्त उत्सर्जन और उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (हमारे परख के लिए फिल्टर: GFP 485/20ex 528/20em, आरएफपी 540/25ex 590/35em) के साथ एक अच्छी तरह से प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए.
2. GFP / आरएफपी के अनुपात की गणना और नियंत्रण कुओं (सक्रिय यौगिक के बिना) की रीडिंग के साथ प्रतिदीप्ति व्यक्तिगत उपचार से व्युत्पन्न तीव्रता के सटीक गुना अंतर को निर्धारित मानक के अनुसार.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

हमारे SKN एक परख एक chromosomally एकीकृत दोहरी संवाददाता तनाव (VP596) का उपयोग करता है. जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, कीड़े की संख्या अच्छी तरह से तिरस्कृत मात्रा के लिए सहसंबद्ध है. के रूप में अच्छी तरह से प्रति 2A और 2B, कुल GFP और आरएफपी प्रतिदीप्ति आंकड़े में दिखाया गया है से अच्छी तरह से अच्छी तरह से भर में एक 384 अच्छी तरह से थाली अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. भर में 384 कुओं आरएफपी: GFP प्रतिदीप्ति रैखिक Pdop-3 के लिए सहसंबद्ध है: के रूप में चित्रा 2C, संयुक्त राष्ट्र प्रेरित Pgst-4 में दिखाया गया है. आरएफपी के लिए परिवर्तनशीलता को कम संवाददाता: जब GFP / आरएफपी के अनुपात के रूप में व्यक्त, प्रतिदीप्ति अत्यधिक 384 अच्छी तरह से थाली Pdop-3 की क्षमता का प्रदर्शन (2A करने के लिए 2D चित्रा से विभिन्नता का गुणांक तुलना) के पार से अच्छी तरह से अच्छी तरह से करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो जाता है. जैसा चित्रा 3, GFP रिश्तेदार के साथ आरएफपी के लिए प्रेरण में दिखाया गया है है एक SKN 1 xenobiotic सक्रिय (38 सुक्ष्ममापी juglone) मजबूत और एक 384 अच्छी तरह से थाली भर में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है.

चित्रा 1 मात्रा बनाम कीड़े की संख्या तिरस्कृत. कीड़े लगभग 2/μl पतला रहे थे और एक 24 stereomicroscope साथ मैनुअल गिनती के लिए अच्छी तरह से थाली में तिरस्कृत. एन = मात्रा प्रति 8 कुओं.

चित्रा 2 एक 384 अच्छी तरह से थाली में तिरस्कृत कीड़े का कुल प्रतिदीप्ति प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. कीड़े लगभग 2.5/μl और 30 μl पतला थे एक 384 अच्छी तरह से थाली की हर अच्छी तरह से में तिरस्कृत किया गया था. GFP (ए) और आरएफपी सभी कुओं की प्रतिदीप्ति (बी) 9% से नीचे परिवर्तन की एक गुणांक था. (सी) GFP प्रतिदीप्ति अत्यधिक आरएफपी प्रतिदीप्ति के लिए सहसंबद्ध है. (डी) आरएफपी के लिए GFP के अनुपात में गिना 6% से नीचे विभिन्नता का गुणांक कम (ए, बी, और डी) ठोस लाइनों का मतलब है संकेत मिलता है और टूटी लाइनों मतलब ऊपर या नीचे तीन मानक विचलन से संकेत मिलता है.

Pgst-4 के 3 चित्रा सक्रियकरण: GFP मजबूत और लगातार है. लगभग 75 L4 कीड़े 384 अच्छी तरह से थाली और 38 सुक्ष्ममापी juglone के सभी कुओं में तिरस्कृत किया गया हर दूसरे स्तंभ में जोड़ा गया है. GFP और आरएफपी प्रतिदीप्ति ऊष्मायन के 21 घंटे के बाद मापा गया था. सभी नियंत्रण का मतलब रिश्तेदार प्रतिदीप्ति अनुपात (1.0) और juglone कुओं (8.9) ठोस लाइनों के साथ चिह्नित हैं. नियंत्रण ऊपर तीन मानक विचलन मतलब है और juglone मतलब नीचे टूटी लाइनों के साथ चिह्नित हैं.

Discussion

हम संवर्धन के लिए एक तरीका मौजूद है और ट्रांसजेनिक नेमाटोड के बड़ी संख्या में वितरण. कीड़े संवर्धन के लिए उपकरणों का इस्तेमाल किया आणविक क्लोनिंग प्रदर्शन प्रयोगशालाओं के लिए मानक है और तरल से निपटने और प्रतिदीप्ति उपकरण microplates के बड़ी संख्या प्रसंस्करण प्रयोगशालाओं के लिए मानक है. जीना सी. की बड़ी संख्या के वितरण के अन्य तरीके एलिगेंस महंगी कण ¹⁹ छँटाई उपकरण की आवश्यकता होती है. Pgst 4:: GFP परख टोपी 'एन' कॉलर प्रतिलेखन कारकों के छोटे अणु modulators के लिए स्क्रीन के लिए और पर्यावरण ^और खाद्य 14,16 नमूनों में xenobiotic और ऑक्सीडेंट contaminants के पता लगाने में इस्तेमाल किया जा सकता है. मजबूत inducible ट्रांसजेनिक GFP संवाददाताओं रास्ते और पर्यावरण उत्तेजनाओं ⁴ की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपलब्ध हैं, और इसलिए हमारे विधि कई रास्ते के विकास modulators करने के लिए लागू हो सकता है और contaminants के एक व्यापक स्पेक्ट्रम का पता लगाने चाहिए.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth	Research Products International Corp.	L24066
Terrific broth	Research Products International Corp.	T15100
Synergy HT Multi-mode Microplate Reader	BioTek		Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em
MicroFlo Select Dispenser	BioTek
Worm dispensing flask	Southern Scientific Inc., Micanopy, FL		Custom assembled(352) 284-2531
384 microplates	Greiner Bio-One	5678-1209
Breathable sealing tape	Nalge Nunc international	241205
(5-hydroxy-p-naphthoqinone)Juglone	Acros Organics	121640010	Juglone is dissolved in DMSO
DMSO	Sigma-Aldrich	D-5879
C. elegans transgenic strain	Author’s laboratory	VP596	Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP