Summary
Een procedure voor vloeibare-based kweken en verstrekking van
Abstract
High-throughput screening (HTS) is een krachtige aanpak voor het identificeren van chemische modulatoren van biologische processen. Er zijn echter vele stoffen die in schermen met behulp van celkweek modellen vaak te toxisch of farmacologisch inactief worden in vivo 1-2. Screening in hele diermodellen kunnen helpen deze valkuilen te vermijden en het stroomlijnen van de weg naar de ontwikkeling van geneesmiddelen.
C. elegans is een meercellig organisme model zeer geschikt voor HTS. Het is klein (<1 mm) en economisch kunnen worden gekweekt en afgeleverd in vloeistoffen. C. elegans is ook een van de meest handelbare experimenteel diermodellen waarbij een snelle en gedetailleerde identificatie van de drug mode-van-actie 3.
Beschrijven we een protocol voor het kweken en het doseren van tl-stammen van C. elegans voor high-throughput screening van chemische bibliotheken of het opsporen van milieuverontreinigende stoffen die de expressie van een specifiek gen wijzigen. Grote aantallen ontwikkelingsgebied gesynchroniseerde wormen worden gekweekt in vloeibare cultuur, geoogst, gewassen en opgehangen in een bepaalde dichtheid. Wormen zijn vervolgens toegevoegd aan zwarte, platte bodem 384-wells platen met behulp van een peristaltische vloeistof dispenser. Kleine moleculen van een chemische bibliotheek of proefmonsters (bijvoorbeeld water, voedsel, of bodem) kunnen worden toegevoegd aan putten met wormen. In vivo, real-time fluorescentie-intensiteit wordt gemeten met een fluorescentie microplaat reader. Deze methode kan worden aangepast aan een induceerbaar gen in C. elegans waarvoor een geschikte verslaggever beschikbaar is. Veel induceerbare stress en ontwikkelingsstoornissen transcriptionele paden zijn goed gedefinieerd in C. elegans en GFP transgene reporter stammen al bestaan voor velen van hen 4. In combinatie met de juiste transgene verslaggevers, kan onze methode worden gebruikt voor het screenen op pad modulatoren of de robuuste biosensor testen te ontwikkelen voor milieucontaminanten.
We tonen onze C. elegans cultuur en het doseren van het protocol met een HTS-test hebben we ontwikkeld om de C. te controleren kraag transcriptie elegans cap 'n' factor SKN-1. SKN-1 en de zoogdier-homoloog Nrf2 activeren cytoprotectieve genen tijdens oxidatieve stress-en xenobiotische 5-10. Nrf2 beschermt zoogdieren uit tal van leeftijd-gerelateerde aandoeningen zoals kanker, neurodegeneratie, en chronische ontstekingen en is uitgegroeid tot een belangrijke chemotherapeutische doelwit 11-13. Onze test is gebaseerd op een GFP transgene verslaggever voor de SKN-een target-gen gst -4 14, dat codeert voor een glutathion-s-transferase 6. De gst -4 reporter is ook een biosensor voor xenobiotische en oxidatieve stoffen die SKN-1 te activeren en kan gebruikt worden om lage niveaus van verontreinigende stoffen zoals acrylamide en methyl-kwik 15-16 te detecteren.
Protocol
1. De voorbereiding van bacteriële worm voedsel
Dag 1
- Voeg 5 ml van de verzadigde E. coli OP50 bacteriecultuur tot 500 ml bouillon Terrific aangevuld met 50 ug / ml streptomycine en in een incubator schudden (225 rpm) 's nachts bij 37 ° C te groeien
Dag 2
- Splits de nacht bacteriecultuur in tien 50 ml en centrifugeer bacteriën in een gekoelde centrifuge bij 2500 RCF gedurende 20 minuten.
- Afgeschonken LB bouillon en resuspendeer elke bacteriële pellet in 10 ml vloeistof nematode groei media (NGM). Schudden horizontaal in een vloer shaker gedurende 15 minuten om de bacteriën te mengen. Te maken NGM buffer, voeg 3 g NaCl aan een L gedeïoniseerd water en autoclaaf. Afkoelen tot 55 ° C en toe te voegen om de volgende steriele oplossingen: 1 ml van 1 M CaCl 2, 1 ml van 1 M MgSO 4, en 25 ml van 1 M kalium fosfaat, pH 6,0.
- Centrifugeer de bacteriecultuur in een gekoelde centrifuge bij 2500 RCF gedurende 20 minuten.
- Afgeschonken NGM buffer en wegen de bacteriële pellet.
- Voeg een gelijk volume van NGM buffer om de pellets, hoeveelheid van 3 ml concentraat bacteriën in 15 ml buizen, en bewaar bij -20 ° C. resuspenderen
2. Grootschalige C. elegans vloeibare cultuur
We maken gebruik van een transgene lijn VP596 (dvIs19 [pAF15 (GST-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [DOP-3:: RFP]) met twee TL-constructen: Pgst -4:: GFP 14 tot SKN-1 monitor activiteit en PDOP-3:: RFP 17 om te dienen als een standaard voor de worm nummer normalisatie.
Dag 1
- Meng 150 ml NGM buffer, 1,5 ml LB-bouillon, 150 pl van 5 mg / ml cholesterol (in ethanol), en 75 pi van 100 mg / ml streptomycine. Filter-steriliseren van het mengsel en voeg een 1 liter steriele kolf.
Opmerking: Het toevoegen van 1% LB-bouillon aan NGM buffer helpt om wormen te voorkomen dat het vasthouden aan glaswerk en plastic, maar dit bedrag is niet genoeg om de groei van bacteriën te ondersteunen. - Synchroniseer wormen met de standaard hypochloriet procedure 18. Maximaal 0,5 ml van zwangere wormen kan worden verwerkt in een 15 ml buis met 5 ml van hypochloriet oplossing (3,75 ml steriel water, 1 ml bleekmiddel, en 250 ul 10 N NaOH). Was de vrijgekomen eieren met steriel water en resuspendeer ze in 10 ml van NGM buffer.
- Verdun een steekproef van de eieren 100 vouw in NGM buffer (bv. 100 pi in 10 ml) en tel het aantal eieren in drie afzonderlijke 5 ul aliquots. Meerdere het gemiddelde aantal van 200.000 (100 verdunningsfactor x 2.000) van het totale aantal eieren te schatten.
- Voeg toe 200.000 naar 2 miljoen eieren aan de kolf met NGM buffer en schud de cultuur bij 100 tpm bij 20 ° C.
Dag 2
- Minimaal 16 uur na het toevoegen van eieren aan de kolf, gebruik dan een steriel serologische pipet tot ongeveer 0,5 ml van de geschorste worm cultuur te verwijderen. Pipet drie 5 pl druppels op de steriele deksel van een petrischaal. Plaats het deksel in een -20 ° C vriezer gedurende 1-2 minuten om wormen te verlammen. Tel het gemiddelde aantal levende uitgekomen wormen per 5 ul en vervolgens meerdere met 30.000 (150 ml / 5 ul) om het totale aantal uitgekomen wormen te schatten.
- Dooi een buis van bevroren OP50 bacteriecultuur (Protocol 1.6) en voeg 3 ml van 50% OP50 in de worm cultuur per 500.000 uitgekomen wormen. Schudden de kolf bij 100 tpm bij 20 ° C. Worms zal ontwikkelen tot L4 larven en jonge volwassenen in ongeveer 51 uur. De OD600 van bacteriën moet ongeveer 2.200 aan het begin. Controleren het bedrag van bacteriën door absorptie en voeg meer als de OD 600 daalt onder 0.900.
3. Worm verzamelen en doseren
Dag 4
- Gebruik een steriele serologische pipet tot ongeveer 0,5 ml van de geschorste worm cultuur over te dragen aan een standaard NGM agarplaat. Bekijk de wormen met een stereomicroscoop om ervoor te zorgen dat de meeste zijn L4 larven of jonge volwassenen. L4 larven hebben een ventrale duidelijke plek in het midden van het lichaam. Jonge volwassenen worden iets groter en zal niet een duidelijke plek.
- Giet de worm cultuur in steriele 50 ml buizen en plaats de buizen in een reageerbuis rek op het werkblad. Laat de wormen genoegen te nemen met ongeveer 10 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie of pipetteren.
OPMERKING: Deze stap kan belangrijk zijn om unhatched eieren of wormen die niet ontwikkelde verwijderen omdat ze langzamer dan L4 larven en jonge volwassenen af te wikkelen. - Verzamel alle wormen in een 50 ml buis en wassen met NGM buffer met 1% LB-bouillon (NGM + LB) 3-4 keer om bacteriën te verwijderen.
LET OP: Dit kan het beste gedaan in een swingende-bucket centrifuge door het verzamelen van wormen bij 500 RCF voor 30 sec en het vervangen van het supernatant met verse NGM + LB buffer. - Na het wassen, vul de buis met NGM + LB buffer tot 50 ml en giet het in een aangepaste dosering worm kolf. Voeg een klein roer bar en roer om de wormen opgeschort. Tellen ee aantal wormen in drie 5 pl druppels zoals hierboven aangegeven. Verdunnen met NGM + LB tot je 12 tot 15 wormen per 5 pi druppel (~ 2.5-3.0 wormen / ul).
LET OP: Een minimum van ongeveer 20 ml (60.000 wormen) is nodig om de dode ruimte van de verstrekking kolf en dispenser cassette te vullen. Elke 384 wells plaat is ongeveer 35.000 wormen of 11,5 ml van de geschorste wormen. - Laad een 10 ul doseren cassette en steriliseer door priming met 70% ethanol. Spoel de ethanol door priming met steriel water.
- Steek het uiteinde van de verstrekking cassette in de kolf zodat het net boven de roerstaafje zonder verstoring van de beweging. Zorg ervoor dat de wormen blijven hangen in de hele kolf. Programmeer de dispenser af te zien bij een lage snelheid met 2 pre-pulsen. Prime en lopen ten minste 10 ml van de geschorste wormen. Vul platen zo snel nodig is om de wormen te voorkomen dat de vestiging in de slang.
- Afdichting van de platen met ademende tape.
- Leg de platen op een schudden platform in een couveuse op de juiste temperatuur voor uw test. Niet stapelen van de platen.
4. Fluorescentie analyse
- Leg het doel plaat in een microplaat lezer om de fluorescentie-intensiteit van elk goed te meten met de juiste emissie en excitatie golflengte (Filters voor onze test: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em).
- Bereken de verhouding van GFP / RFP en normaliseren met de lezingen van de controle putten (zonder activering compound) om de exacte voudig verschil van de fluorescentie-intensiteit afgeleid uit individuele behandelingen te bepalen.
5. Representatieve resultaten:
Onze SKN-1-test maakt gebruik van een chromosomaal geïntegreerde dual reporter stam (VP596). Zoals weergegeven in figuur 1, is het aantal wormen goed gecorreleerd aan verspoten volume. Zoals in de figuren 2A en 2B, totale GFP en RFP fluorescentie per well is zeer reproduceerbare van goed tot goed over een 384 wells plaat. Zoals weergegeven in figuur 2C, on-geïnduceerde Pgst-4:: GFP fluorescentie is lineair gecorreleerd aan PDOP-3:: RFP over 384 putten. Uitgedrukt als een verhouding van GFP / RFP, fluorescentie wordt zeer reproduceerbaar uit goed om goed over een 384 wells plaat (vergelijk variatiecoëfficiënt van figuur 2D naar 2A) tonen het vermogen van de PDOP-3:: RFP reporter om de variabiliteit te verminderen. Zoals weergegeven in figuur 3, de inductie van GFP ten opzichte van RFP met een SKN-1 activeren milieuvreemde (38 uM juglone) is robuust en zeer reproduceerbare over een 384 wells plaat.
Figuur 1. Aantal wormen versus volume gedoseerd. Wormen werden verdund tot ongeveer 2/μl en gedispenseerd in een 24 wells plaat voor handmatige telling met een stereomicroscoop. N = 8 wells per volume.
Figuur 2. Totale fluorescentie van wormen gedispenseerd in een 384 wells plaat is reproduceerbaar. Wormen werden verdund tot ongeveer 2.5/μl en 30 pi werd verstrekt in ieder putje van een 384 wells plaat. GFP (A) en RFP (B) fluorescentie van alle putten hadden een variatiecoëfficiënt minder dan 9%. (C) GFP-fluorescentie is sterk gecorreleerd aan RFP fluorescentie. (D) berekening van de verhouding van GFP aan RFP verminderde de variatiecoëfficiënt tot onder de 6% (A, B en D) Vaste lijnen geven de middelen en gebroken lijnen geven drie standaarddeviaties boven of onder het gemiddelde.
. Figuur 3 Activering van Pgst-4:: GFP is robuust en consistent. Ongeveer 75 L4 wormen werden afgegeven in ieder putje van een 384 goed bord en 38 uM juglone werd toegevoegd in elke andere kolom. GFP en RFP fluorescentie werd gemeten na 21 uur incubatie. De gemiddelde relatieve fluorescentie verhoudingen van alle controle (1.0) en juglone Wells (8,9) zijn gemarkeerd met doorgetrokken lijnen. Drie standaarddeviaties boven het gemiddelde en controle onder de juglone betekenen zijn gemarkeerd met gebroken lijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren een methode voor het kweken en het doseren van grote aantallen transgene nematoden. De apparatuur wordt gebruikt voor het kweken van wormen is standaard voor de laboratoria die moleculaire klonen en de liquid handling-en fluorescentie-apparatuur is standaard voor laboratoria het verwerken van grote aantallen microtiterplaten. Andere methoden van doseren grote aantallen van de live C. elegans dure deeltje gesorteerd apparatuur 19. De Pgst-4:: GFP assay kan worden gebruikt voor het screenen op kleine molecule modulatoren van de kraag transcriptie cap 'n' factoren en lichaamsvreemde en oxidant verontreinigingen op te sporen in het milieu en voedsel stalen 14,16. Robuuste induceerbare transgene GFP verslaggevers zijn beschikbaar voor een breed scala van paden en het milieu stimuli 4, en daarom onze methode moeten gelden voor het ontwikkelen van modulatoren van de vele paden en een breed spectrum van verontreinigingen op te sporen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
C. elegans transgenen werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Dit werk werd ondersteund door NIH R21 verlenen NS0667678-01 naar KS. Alle auteurs namen deel aan het verzamelen, analyseren en interpreteren van gegevens. CKL, KS, en KPC deelgenomen aan het schrijven en de herziening van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled(352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nalge Nunc international | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone)Juglone | Acros Organics | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
References
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).
- WormBase [Internet]. , Available from: http://www.wormbase.org (2012).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
- Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).
- Hasegawa, K. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
- Tullet, J. M. A. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell. 132, 1025-1038 (2008).
- Oliveira, R. P. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell. , Forthcoming (2009).
- Park, S. -K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8, 258-269 (2009).
- Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal. , (2010).
- Kwak, M. K., Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).
- Leiser, S. F., Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).
- Link, C. D., Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).
- Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci. , (2010).
- Hasegawa, K. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).
- Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).
- Hope, I. A. C. elegans, a Practical Guide. , Oxford University Press. (2005).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).
