Summary
Sıvı tabanlı kültür ve dağıtımı için bir prosedür
Abstract
Yüksek verim tarama (HTS), biyolojik süreçler kimyasal modülatörleri tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. Ancak, hücre kültürü modelleri kullanarak ekranlar tanımlanan birçok bileşikler genellikle, in vivo 1-2 toksik ya da farmakolojik olarak inaktif olarak bulunmuştur . Tüm hayvan modellerinde de Eleme Bu tuzaklardan kaçınmak ve ilaç geliştirme yolunu düzene yardımcı olabilir.
C. elegans, iyi HTS için uygun bir çok hücreli bir model organizmadır. Küçük (<1 mm) ve ekonomik kültürlü ve sıvılarda reçete edilmesi C. elegans, ilaç modu-aksiyon 3 hızlı ve ayrıntılı kimlik izin, en deneysel olarak izlenebilir hayvan modellerinde de biridir.
Biz kültür için bir protokol tanımlayan ve C floresan suşları dağıtım kimyasal kütüphaneleri veya belirli bir gen ifadesini değiştiren çevresel kirleticiler tespit yüksek verim tarama için elegans. Çok sayıda gelişimsel senkronize solucanlar, sıvı kültüründe yetişen hasat, yıkanmış ve belirli bir yoğunlukta asılı. Worms peristaltik bir sıvı dağıtıcı kullanarak siyah, düz tabanlı 384-kuyucuğu sonra eklenir. Küçük moleküllerin kimyasal bir kütüphane ya da test örnekleri (örneğin, su, gıda, veya toprak), solucanlar ile kuyu eklenebilir. In vivo olarak, gerçek zamanlı floresan bir floresan mikroplak okuyucu ile ölçülür . Bu yöntem, C herhangi bir indüklenebilir gen adapte edilebilir uygun bir muhabir kullanılabilir olduğu elegans. Birçok indüklenebilir stres ve gelişim transkripsiyonel yollar C ile tanımlanır elegans ve GFP transgenik muhabiri suşları zaten onları 4 pek çok var. Uygun transgenik gazetecilere ile kombine edildiğinde, yöntem yolağı modülatörleri ekrana veya çevresel kirleticiler için sağlam bir biyosensör deneyleri geliştirmek için kullanılabilir.
Biz C. göstermektedir elegans kültür ve dağıtım protokolü bir HTS testi ile C. izlemek için geliştirilen elegans kap 'n' yaka transkripsiyon faktörü SKN-1. SKN-1 ve memeli homologu Nrf2 5-10 ve ksenobiyotik oksidatif stres sırasında sitoprotektif genler aktif hale getirin. Nrf2 memeliler, kanser nörodejenerasyon ve kronik inflamasyon gibi pek çok yaşa bağlı bozukluklar korur ve büyük bir kemoterapötik hedef 11-13 haline gelmiştir. Tahlil -4 SKN-1 hedef geni gst 14 GFP transgenik muhabiri dayalı , glutatyon-s transferaz 6 kodlar. Gst -4 muhabiri SKN-1 etkinleştirin ve akrilamid ve metil-civa 15-16 gibi kirleticilerin düşük seviyelerde tespit etmek için kullanılan olabilir ksenobiyotik ve oksidatif kimyasallar için de bir biyosensör.
Protocol
1. Bakteriyel solucan gıda hazırlanması
1. Gün
- 5 ml doymuş E. ekle 50 mg / ml streptomisin coli OP50 bakteri kültürü 500 ml Terrific suyu ile desteklenmiş ve sallayarak inkübatör (225 rpm) bir gecede büyümek 37 ° C
2. Gün
- 20 dakika boyunca 2500 RCF soğutmalı santrifüj on 50 ml tüpler ve santrifüj bakteri içine Split gecede bakteri kültürü.
- LB suyu kapalı Durusu ve 10 ml sıvı nematod büyüme ortam (NGM) her bakteriyel pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Bakterilerin tekrar süspansiyon 15 dakika boyunca yatay bir zemin çalkalayıcı çalkalayınız. NGM tampon yapmak için 3 gr NaCl, 1 L deiyonize su ve otoklav ekleyin. Serin - 55 ° C ve steril çözümler için aşağıdaki ekleyin: 1 ml 1 M CaCl 2, 1 M MgSO 4 1 ml, 25 ml ve 1 M potasyum fosfat, pH 6.0 .
- 20 dakika boyunca 2500 RCF soğutmalı santrifüj bakteri kültürü santrifüjleyin.
- NGM tampon kapalı Durusu ve bakteriyel pelet tartmak.
- Granül, kısım bakteri 3 ml, 15 ml tüpler ve mağaza içine konsantre -20 ° C tekrar süspansiyon NGM tampon eşit hacimde
2. C. Büyük ölçekli elegans sıvı kültürü
Biz bir transgenik satırını kullanın VP596 (dvIs19 [pAF15 (gst-4:: GFP: NLS)]; vsIs33 [dop-3: TÇD) iki floresan yapıları taşıyan SKN-1 izlemek için GFP 14: Pgst: -4 aktivite ve Pdop-3: RFP 17 solucan sayısı normalleşmesi için bir standart olarak hizmet vermektedir.
1. Gün
- 150 ml, 1.5 ml LB suyu, 5 mg / ml 'kolesterol (etanol) 150 ul, 100 mg / ml streptomisin 75 ul NGM tampon karıştırın. Karışımı Filtre sterilize ve 1 litre steril erlene ekleyin.
NOT:% 1 LB suyu NGM tampon ekleme, solucanlar, cam ve plasticware yapışmasını önlemek için yardımcı olur, ancak bu miktar bakteri büyümeyi desteklemek için yeterli değildir. - Solucanlar standart hipoklorit prosedürü 18 ile senkronize etme. Hipoklorit solüsyonu 5 ml (3.75 ml steril su, 1 ml çamaşır suyu, ve 250 ul 10 N NaOH) ile 0.5 ml gravid solucanlar, tek bir 15 ml tüp içinde işlenebilir. Bırakılan yumurta steril su ile yıkayın ve 10 ml NGM tampon tekrar süspansiyon haline getirin.
- Yumurta NGM tampon 100 kat (örneğin, 10 ml 100 ul) bir örnek seyreltilir ve üç ayrı 5 ul alikotları yumurta sayısını. Çoklu 200.000 (100 seyreltme faktörü x 2,000), ortalama toplam yumurta sayısını tahmin etmek.
- NGM tamponu ile şişesi için 200.000 'e 2 milyon yumurta ekleyin ve kültür sallamak 100 rpm'de 20 ° C.
2. Gün
- Erlene yumurta ekledikten sonra en az 16 saat asılı bir solucan kültür yaklaşık 0,5 ml kaldırmak için steril bir serolojik pipetlemeyin kullanın. Petri kabı steril kapak üzerine üç pipetleyin 5 ul damla. Solucanlar felç için 1-2 dakika boyunca -20 ° C derin dondurucu kapağı yerleştirin. Yumurtadan solucanlar toplam sayısını tahmin etmek için ortalama sayısı 30.000 (150 ml / 5 ul) 5 ul ve sonra birden başına canlı yumurtadan solucanlar güvenin.
- Dondurulmuş OP50 bakteri kültürü (Protokol 1.6) bir tüp çözülme ve 500.000 yumurtadan solucanlar başına solucan kültürü içine 3 ml% 50 OP50 ekleyin. Şişeyi çalkalayın 100 rpm'de 20 ° C. Worms L4 larva ve genç erişkinlerde yaklaşık 51 saat içinde dönüşecek. Bakteri OD600 başında 2.200 hakkında olmalıdır. Absorbans bakteri miktarı Monitör ve daha eklemek OD 600 aşağıdaki 0.900 düşerse.
3. Solucan toplama ve dağıtım
4. Gün
- Standart bir NGM agar plaka askıya solucan kültür yaklaşık 0.5 ml transfer etmek için steril bir serolojik pipetlemeyin kullanın. En L4 larva veya genç erişkinlerde olduğunu emin olmak için bir stereomikroskopta solucanlar. L4 larvaları ventral vücut ortasında bir açık nokta olacaktır. Genç yetişkinler, biraz daha büyük ve net bir nokta olmayacaktır olacak.
- Solucan kültürü steril 50 ml tüpler içine dökün ve bir test tüpü rakı benchtop tüpler. Solucanlar, yaklaşık 10 dakika boyunca yerleşmek için izin verin. Aspirasyonu veya pipetleme süpernatantı.
NOT: Bu adım, L4 larva ve genç erişkinlerde daha yavaş yerleşmeye çünkü çıkmamış yumurta veya geliştirmek değil solucanları kaldırmak için önemli olabilir. - NGM tamponu ile 1% LB suyu (NGM + LB) bakteriler kaldırmak için 3-4 kez 50 ml tek bir tüp ve yıkama tüm solucanları toplayın.
NOT: Bu en iyi 30 saniye için 500 RCF solucanlar toplama ve taze NGM + LB tampon ile süpernatantı yerine bir sallanan kovası santrifüj yapılır. - Yıkadıktan sonra, 50 ml + NGM LB tampon tüp doldurmak ve özel bir solucan dağıtımı şişesi içine dökünüz. Küçük bir heyecan çubuğuna ekleyin ve solucanlar askıda tutmak için karıştırın. Kasım Sayısıüç 5 ul damla solucanlar e numarası yukarıda da belirtildiği gibi. 5 ul damla (~ 2,5-3,0 solucanlar / ml) ortalama 12-15 solucanlar kadar NGM + LB ile sulandırınız.
NOT: yaklaşık 20 ml (60.000 solucanlar) en az dağıtım şişesi ve dağıtıcı kaset ölü boşluğu doldurmak için gereklidir. Her 384 plaka yaklaşık 35.000 solucan veya askıya solucanlar 11.5 ml gerektirir. - 10 ul dağıtım kaset Yük ve% 70 etanol ile astarlanırsa ile sterilize edin. Steril su ile astarlanırsa etanol durulayın.
- Sadece hareketini bozmadan heyecan bar üstünde olduğunu balona dağıtım kaset takın. Solucanlar tüm şişesi boyunca askıda kalır emin olun. Program, dağıtıcı, 2 pre-bakliyat ile düşük hızda dağıtmak için. Başbakan ve askıya solucanlar en az 10 ml çalıştırın. Plakalar, tüp yerleşen solucanları önlemek için hızlı bir şekilde gerektiği gibi doldurun.
- Nefes bant ile plakaları.
- Tayini için uygun sıcaklıkta bir inkübatör sallayarak platformu tabak koyun. Plakalar koymayın.
4. Floresans analizi
- Uygun emisyon ve dalgaboyu (:; RFP 540/25ex 590/35em GFP 485/20ex 528/20em tayini için Filtreler) ile her bir kuyunun floresan yoğunluğu ölçmek için bir mikroplaka okuyucu hedef plakası yerleştirin.
- GFP / RFP oranını hesaplayın ve bireysel tedavi edilen floresan yoğunluğu tam kat farkı belirlemek için kontrol kuyuları (aktive bileşik olmadan) okuma normalleştirmek.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Bizim SKN-1 testinin kromozomal olarak entegre bir çift muhabiri suşu (VP596) kullanır. Şekil 1'de gösterildiği gibi, solucanlar sayıda reçete hacmi de ilişkilidir. De ortalama Şekil 2A ve 2B, toplam GFP ve RFP floresan görüldüğü gibi son derece iyi bir 384 plaka iyi çapında tekrarlanabilir. RFP çapında 384 kuyu: GFP floresan doğrusal Pdop-3 ile korele: un bağlı Pgst-4 Şekil 2C, gösterilmiştir. Değişkenliği azaltmak için RFP muhabiri: GFP / RFP bir oranı olarak ifade edildiğinde, floresan Pdop-3 yeteneğini gösteren 384 plaka (2B Şekil 2A varyasyon katsayısı karşılaştırmak) karşısında kuyudan yüksek tekrarlanabilir hale gelir . Şekil 3 ile RFP GFP göreli indüksiyon gösterildiği gibi bir SKN-1 ksenobiyotik aktive (38 mcM juglone'un) 384 plaka boyunca son derece sağlam ve tekrarlanabilir.
Şekil 1 hacim karşı solucanlar sayısı vazgeçtik. Worms yaklaşık 2/μl seyreltilir ve bir stereomikroskopta manuel sayım için 24 plaka halinde dağıtıldı. N = 8 kuyu hacim başına.
Şekil 2. Toplam 384 plaka boşaltılan solucanlar floresan tekrarlanabilir. Worms, yaklaşık 2.5/μl ve 30 ul seyreltilir 384 plaka her kuyuya dağıtılır oldu. Tüm kuyuların GFP (A) ve TTT (B) floresan varyasyon katsayısı% 9 altında vardı. (C) GFP floresan yüksek RFP floresan ilişkilidir. (D)% 6 altında RFP için GFP oranı hesaplanması için varyasyon katsayısı azaltılmış (A, B, ve D) Düz çizgiler anlamına gelir gösterir ve kırık çizgiler, ortalamanın altında veya üstünde üç standart sapma gösterir.
Pgst-4 Şekil 3 Etkinleştirme: GFP sağlam ve tutarlı. Yaklaşık 75 L4 solucanlar 384 plaka ve 38 mcM juglone'un tüm kuyulara dağıtıldı diğer her sütun eklendi. GFP ve RFP floresan inkübasyon 21 saat sonra ölçüldü. Ortalama bağıl floresan tüm kontrol oranları (1.0) ve juglone'un kuyuları (8,9) katı çizgilerle işaretlenmiştir. Ortalama kontrol yukarıdaki üç standart sapma ve juglone'un ortalama altında kırık hatları ile işaretlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz kültür için bir yöntem mevcut ve transgenik nematodların çok sayıda dağıtım. Kültür solucanları için kullanılan ekipman, moleküler klonlama gerçekleştiren laboratuarlar için standart ve sıvı taşıma ve çok sayıda mikropleytin işleme laboratuarları için standart floresan ekipman. Diğer çok sayıda canlı C. dağıtım yöntemleri elegans pahalı ekipmanlar 19 sıralama parçacık gerektirir. Pgst-4: GFP tahlil kap 'n' yaka transkripsiyon faktörlerinin küçük molekül modülatörler için ekran ve çevre ve gıda örnekleri 14,16 ksenobiyotik ve oksidan kirleticiler tespit etmek için kullanılabilir. Sağlam indüklenebilir transgenik GFP gazetecilere, yollar ve çevresel uyaranlara 4 geniş bir yelpazesi için kullanılabilir ve bu nedenle bizim yöntemi birçok yollar gelişmekte modülatörleri için geçerli olmalı ve geniş bir yelpazede kirletici madde tespit etmek için .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
C. elegans transgenlerin Caenorhabditis Genetik Merkezi (Minnesota Üniversitesi, Minneapolis, MN) tarafından verilmiştir. Bu çalışma NIH R21 hibe NS0667678 KS-01 tarafından desteklenmiştir. Tüm yazarlar katıldı toplanması, analizi ve verilerin yorumlanması. CKL, KS ve KMG yazının yazımı ve gözden geçirilmesi katıldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled(352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nalge Nunc international | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone)Juglone | Acros Organics | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
References
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).
- WormBase [Internet]. , Available from: http://www.wormbase.org (2012).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
- Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).
- Hasegawa, K. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
- Tullet, J. M. A. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell. 132, 1025-1038 (2008).
- Oliveira, R. P. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell. , Forthcoming (2009).
- Park, S. -K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8, 258-269 (2009).
- Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal. , (2010).
- Kwak, M. K., Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).
- Leiser, S. F., Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).
- Link, C. D., Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).
- Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci. , (2010).
- Hasegawa, K. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).
- Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).
- Hope, I. A. C. elegans, a Practical Guide. , Oxford University Press. (2005).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).
