הגבלת תא דילול מבחני השתלת משמשות כדי לקבוע את התדירות של גידולים להפצת תאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת דג הזברה syngeneic כי לפתח לוקמיה fluorescently שכותרתו ופרטים כיצד לבודד השתלת תאים אלה לוקמיה על הגבלת דילול לתוך חלל הצפק של דג הזברה מבוגר.
עצמית חידוש תאים סרטניים הם תאים מסוגים רק בתוך הגידול, כי יש יכולת בלתי מוגבלת כדי לקדם את צמיחת הגידול, ידועים כמו כן הגידול מתפשט תאים או תאים סרטניים, ליזום. הוא חשב כי המיקוד הללו עצמית חידוש תאים להרס תחסום התקדמות הגידול לעצור נסיגה, שיפור משמעותי פרוגנוזה החולה 1. הדרך הנפוצה ביותר כדי לקבוע את תדירות עצמית חידוש תאים בתוך הגידול הוא תא הגבלת דילול השתלת assay, שבו תאים סרטניים הם הושתלו בחיות הנמען במינונים הגדלת; חלקם של בעלי החיים לפתח גידולים משמש לחשב את מספר עצמית חידוש תאים בתוך מדגם הגידול המקורי 2, 3. באופן אידיאלי, מספר רב של בעלי חיים ישמשו בכל ניסוי דילול הגבלת לקבוע במדויק את השכיחות של גידולים להפצת תאים. עם זאת, ניסויים בקנה מידה גדול הכוללים עכברים הם יקרים, ורוב מבחני דילול להגביל את השימוש רק 10-15 עכברים בכל ניסוי.
דג הזברה זכו לגדולה כמודל סרטן, במידה רבה בשל הקלות שלהם מניפולציה גנטית והכלכלה שבה ניסויים בקנה מידה גדול יכול להתבצע. בנוסף, סוגי סרטן הדגם של דג הזברה נמצאו מקרוב לחקות את מקבילו האנושי שלהם 4 המחלה. אמנם זה אפשרי להשתיל תאים סרטניים מדגים אחד למשנהו על ידי הקרנה משנה קטלני של חיות הנמען, התחדשות של מערכת החיסון לאחר 21 ימים בדרך כלל גורם רגרסיה הגידול 5. היצירה האחרונה של דג הזברה syngeneic יש להקל מאוד מחקרים השתלת הגידול 6-8. בגלל החיות האלה זהים מבחינה גנטית, נקלטים התאים המושתלים לתוך הגידול וחסונה דגים הנמען הגידול יכול להיות פיקוח על פני תקופות זמן ארוכות. Syngeneic דג הזברה הם אידיאליים עבור הגבלת מבחני השתלת דילול ב כי תאים סרטניים לא צריך להתאים את הגידול microenvironment זרה, אשר עשוי לזלזל עצמית חידוש תדירות תא 9, 10. בנוסף, אחד של השתלות הושלמו בהצלחה באמצעות דג הזברה syngeneic 8 וכמה מאות בעלי חיים ניתן להשתיל בקלות ו כלכלית בעת ובעונה אחת, אשר שניהם משמשים כדי לספק הערכה מדויקת יותר של תדירות עצמית חידוש התאים.
הנה, שיטת מוצג ליצירת העיקרי, fluorescently שכותרתו תא T לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL) ב דג הזברה syngeneic, ואת השתלת גידולים אלה על הגבלת דילול לתוך דגים בוגרים כדי לקבוע תדירות עצמית חידוש התאים. בעוד לוקמיה מסופק כדוגמה, פרוטוקול זה מתאים כדי לקבוע את התדירות של גידולים להפצת תאים סרטניים באמצעות כל מודל של דג הזברה.
הכוח העיקרי של השימוש דג הזברה בחקר הסרטן היא כי מספר רב של בעלי חיים יכול לשמש בעלות נמוכה יחסית. זה חשוב במיוחד בהגבלת תא דילול השתלת מבחני, שם את הפרופורציות של חיות המושתלים כי לפתח גידולים למספר הכולל המושתלים משמשות כדי לקבוע תדירות הגידול ייזום התא. בשיטה המוצגת כאן, מעל 70 מקבל חיות השתלת משמשים לכל assay, מתן אומדן מדויק של מספר גידולים הפצת התא. גם את מספר בעלי החיים המשמשים ואת מנות של התאים הסרטניים המושתלים צריך להיות מותאם מודל סרטן נתון, למשל, אם הניסויים הראשוניים להראות גידולים ייזום תאים הם נדירים, במינונים ההשתלה עשוי להיות שימושי 100,000, 50,000, 10,000 ו -1,000 תאים לכל ההשתלה.
Syngeneic זני דג הזברה שימושיים הגבלת ניתוח דילול. עם זאת, זנים אלה עדיין אינם בשימוש נפוץ במעבדות הכל, כמה דגמים סרטן דג הזברה קיימים רק דגים allogenic. הגבלת תא השתלות דילול ניתן לבצע wild-type זנים שעברו אבלציה החיסון, למרות התדירות העצמית חידוש התא עשוי להיות מחושב 1-10 לקפל גבוה יותר מאשר אם syngeneic דג הזברה שימשו 8. חשוב לציין כי מינון גבוה של תאים אמור לשמש להשתלה לתוך הלא החיסונית, מקבלי מתאימים מוקרן, כמו כמה תאים סרטניים לא ישרדו את ההשתלה microenvironment זרה. בנוסף, גידולים רבים יתחילו לסגת לאחר 21 ימים כאשר מערכת החיסון החי של הנמען מתאוששת, כך חיות יש לבחון את הגידול כל 7 ימים לאחר ההשתלה.
השיטות שהוצגו כאן מתאימים לשימוש עם כל מודל סרטן דג הזברה, ויש להם עד כה נעשה שימוש כדי לקבוע גידולים ייזום תדירות תא T-cell לוקמיה לימפובלסטית חריפה הן 8, ומודל גידולים מוצקים, רבדומיוסרקומה 16. גידולים אלה היו שכותרתו fluorescently ידי הזרקה משותף של עוברים עם oncogene והן סמן פלואורסצנטי, כי ה-DNA שיתוף שמפריד בין, כל תא לבטא את oncogene גם לבטא את חלבון פלואורסצנטי 17. בעוד פלואורסצנציה מומלץ משום שהוא מאפשר מעקב אחר הגידול ללא צורך להקריב את החיה מספק דרך ישר קדימה לבודד תאים סרטניים על ידי FACS, אפשר לתייג תאים סרטניים עם נוגדנים גידולים ספציפיים כדי להקל על מקבלי טיהור שלהם אף מכתים הנוגדן דג הזברה עשויים לדרוש אופטימיזציה.
לבסוף, פעם אחת את השכיחות של גידולים להפצת תאים נקבע לסוג גידול נתון, אפשר להשתמש אלה מבחני לזהות את המנגנונים ששולטים תדירות הנייד שלהם. לדוגמה, תאים סרטניים העיקרי יכולים להיות מטופלים עם מעכבי מסלול ספציפי לפני השתלת הגבלת דילול, או דגים המושתלים עצמם עשויים להיות במינון עם סמים. בנוסף, גנטיקה של גידולים עצמם ניתן לטפל על ידי הזרקת הדגים חד תא הבמה עם בגן של עניין, כך גידולים ראשוניים וכתוצאה מכך יהיה מעל לבטא את הגן. בניסויים אלו, כל השפעה על תדירות עצמית חידוש התא יהיה שנצפתה מבחני דילול מגבילים.
The authors have nothing to disclose.
המימון סופק על ידי NIH מענקים 5T32CA09216-26 (עבור JSB), ו K01 AR055619-01A1 ו 3 K01 AR055619-03S1 (עבור DML), כמו גם על ידי אלכס לימונדה סטנד Foundation, גזע הרווארד Cell מכון האמריקנית לסרטן האגודה.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
Syngeneic zebrafish | References6-8 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |