제한 희석 세포 이식의 assays는 종양 – 세포의 증식 주파수를 결정하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 찬란 – 표시 백혈병 및 성인 zebrafish의 복막 구멍에 희석을 제한에서이 백혈병 세포를 분리 및 이식하는 방법에 세부 사항을 개발 syngeneic zebrafish을 생성하는 방법을 설명합니다.
자기 갱신 암 세포가 종양 성장을 촉진하기 위해 무제한 능력을 가지고 종양 내에있는 유일한 세포 유형이며, 따라서 종양 – 증식 세포 또는 종양 – 시작 세포로 알려져 있습니다. 그것은 파괴를 위해 이러한 자기 갱신 세포를 대상으로하는 것은 크게 환자 예후 (豫后) 1 개선, 종양 진행을 차단하고 재발을 막을 수 있다고 생각합니다. 의 빈도를 결정하는 가장 일반적인 방법은 자기 갱신 종양 내에서 세포를하면 종양 세포가 증가 복용에받는 동물에 이식하는 제한 희석 세포 이식 분석이다; 종양을 개발하는 동물의 비율은 숫자를 계산하는 데 사용됩니다 의 자기 갱신 원래 종양 샘플 2, 3 이내에 세포를. 이상적으로, 동물의 많은 정확하게 종양 – 전파 세포의 빈도를 결정하기 위해 각각의 제한 희석 실험에 사용되는 것입니다. 그러나, 마우스를 포함한 대규모 실험 비용이며, 대부분의 제한 희석 assays 실험마다 10-15 생쥐를 사용합니다.
Zebrafish는 유전자 조작과 대규모 실험을 수행할 수있는가 경제의 그들의 용이성으로 인해 많은 부분에서 암 모델로 프로미넨스를 얻고있다. 또한, zebrafish 모델에서 암 종류 밀접하게 자신의 대응 인간의 질병 4 모방을 발견했습니다. 그것이받는 동물의 하위 치명적인 조사, 21 일 후에 면역 시스템의 재생하여 한 물고기에서 다른 종양 세포를 이식하는 것이 가능이지만 종종 종양 역행 5됩니다. syngeneic zebrafish의 최근 생성은 크게 종양 이식 연구에게 6-8를 촉진하고 있습니다. 동물들이받는 생선, 종양 성장에 견고하게 유전자 동일, 이식 종양 세포의 합치다 있기 때문에 시간이 오랜 기간 동안 모니터링할 수 있습니다. Syngeneic zebrafish 자기 갱신 세포 주파수 9, 10을 과소 평가 수있는 외국 microenvironment 성장에 적응하지 않아도 종양 세포에 희석 이식 assays 제한에 이상적입니다. 또한 한 세포 이식이 성공적으로 자기 갱신 셀 주파수의보다 정확한 견적을 제공하는 역할을 모두하는 쉽고 경제적으로 한 번에 이식 수 있습니다 syngeneic zebrafish 8 수백 동물을 사용하여 완료되었습니다.
여기 방법 syngeneic zebrafish의 기본, 찬란 – 라벨 T – 세포 급성 lymphoblastic 백혈병 (T – ALL) 작성과 자기 갱신 세포 주파수를 결정하기 위해 어른 물고기로 희석을 제한에서 이러한 종양을 이식을 위해 제공됩니다. 백혈병이 예제로 제공되는 동안,이 프로토콜은 zebrafish에 암 모델을 사용하여 종양 – 전파 세포의 빈도를 결정하기 위해 적합합니다.
암 연구에 zebrafish를 사용하여의 주요 장점은 동물의 다수가 상대적으로 저렴한 비용으로 사용할 수있다는 것입니다. 이것은 이식의 총 개수에 종양을 개발 이식 동물의 비율은 종양 세포 – 시작 주파수를 결정하는 데 사용되는 희석 세포 이식의 assays을 제한 특히 중요합니다. 여기서 제시하는 방법에서, 70 이식받는 동물 종양 – 전파 휴대폰 번호의 정확한 견적을 제공하는 분석마다 사용됩니다. 사용된 동물의 숫자와 이식 종양 세포의 방사선이 모두가 주어진 암 모델에 맞게 최적화되어 있어야합니다, 예를 들어, 초기 실험 종양 – 시작 세포가 드물게 보여주면, 유용한 이식 접종은 100,000, 50,000, 10,000 1,000 세포 수 있습니다 이식.
Syngeneic zebrafish의 변종은 희석 분석을 제한에 유용합니다. 그러나 이러한 변종이 아직 일반적으로 모든 실험실에서 사용하고, 일부 암 zebrafish 모델은 allogenic 물고기 존재하지 않습니다. 자동 갱신 셀 주파수가 syngeneic zebrafish가 8을 사용한다면보다 10-100 배 이상으로 계산 수 있지만 제한 희석 세포 transplantations은 면역 절제를받은 야생 형 변종으로 수행할 수 있습니다. 일부 종양 세포가 외국 microenvironment에 이식 생존하지 않습니다, 세포의 큰 복용량이 아닌 면역 일치, 조사받는 사람에 이식에 사용되어야합니다하는 것이 중요합니다. 또한, 많은 종양받는 동물의 면역 시스템이 복구 21일 후 복귀하기 시작되므로 동물은 매 7 일마다 이식 후 종양 성장에 대한 평가해야합니다.
여기에 제시 방법은 zebrafish 암 모델에서 사용하기에 적합하며, 지금까지 결정하는 데 사용되었습니다 종양 – 시작 T – 세포 급성 lymphoblastic 백혈병 8, 고체 종양 모델, rhabdomyosarcoma 16 모두 셀 주파수를. 이러한 종양은 찬란 oncogene과 형광 마커 모두와 배아의 공동 주사로 라벨이 붙지만, DNA 공동 segregates는 oncogene을 표현하는 세포는 형광 단백질 17 표현 때문에. 그것은 동물을 희생하지 않고 종양 성장의 추적 촉진 및 외과 의해 종양 세포를 분리하기 위해 스트레이트 전달 방법을 제공하기 때문에 형광 권장하는 동안, 그것은 자신의 정화를 촉진하는 종양이 특정 업체에 항체로 종양 세포를 분류 할 수 있습니다 , zebrafish에 불구하고 항체 얼룩이 최적화가 필요할 수 있습니다.
마지막으로, 한번 종양 – 증식 세포의 발병률이 주어진 종양의 유형에 대한 결정되었습니다, 그것은 그들의 셀룰라 주파수를 제어 메커니즘을 식별하는 데 이러한 assays를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 기본 종양 세포는 희석 이식, 또는 자신이 마약을 복용한 수 이식 물고기를 제한하기 전에 특정 경로 억제제로 치료하실 수 있습니다. 또한, 종양 자체의 유전자는 결과 기본 종양 유전자를 과다 표현되도록, 관심있는 유전자를 가진 세포 단계 생선을 주사에 의해 조작 수 있습니다. 이 실험에서, 자기 갱신 세포 주파수에 대한 영향은 제한 희석 assays에서 관찰됩니다.
The authors have nothing to disclose.
기금은 NIH 보조금 5T32CA09216 – 26 (JSB) 및 K01 AR055619 – 01A1 3 K01 AR055619 – 03S1 (DML)을,뿐만 아니라 알렉 스의 레모네이드 스탠드 재단, 하버드 줄기 세포 연구소 미국 암에 의해 제공되었습니다 사회.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
Syngeneic zebrafish | References6-8 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |