Limitación de la dilución ensayos de trasplante de células se utilizan para determinar la frecuencia de los tumores se propagan las células. Este protocolo describe un método para generar pez cebra singénico que desarrollan leucemia fluorescente marcado y los detalles de cómo aislar y trasplante de estas células de leucemia en la limitación de dilución en la cavidad peritoneal de los adultos de pez cebra.
Autorrenovables las células cancerosas son los tipos de células sólo dentro de un tumor que tiene una capacidad ilimitada para promover el crecimiento del tumor, y por lo tanto conocido como tumor de propagación células o células iniciadoras del tumor. Se cree que la orientación de estas células de auto-renovación de destrucción bloquear la progresión del tumor y detener la recaída, lo que mejora el pronóstico del paciente 1. La manera más común para determinar la frecuencia de auto-renovación de células de un tumor es una célula de ensayo de transplante de dilución límite, en el que las células tumorales son trasplantadas a animales receptores en dosis cada vez mayores, la proporción de animales que se desarrollan los tumores se utiliza el cálculo del número de auto-renovación de células en la muestra original del tumor 2, 3. Lo ideal sería que una gran cantidad de animales podrían ser utilizados en cada experimento de dilución limitante para determinar con exactitud la frecuencia de los tumores se propagan las células. Sin embargo, experimentos a gran escala con ratones son costosos, y la mayoría de limitar los ensayos de dilución de uso sólo 10-15 ratones por experimento.
Pez cebra se han destacado como un modelo de cáncer, en gran parte debido a su facilidad de manipulación genética y la economía por el que los experimentos a gran escala puede llevar a cabo. Además, los tipos de cáncer modelo de pez cebra se han encontrado para imitar a sus cuatro contraparte enfermedades humanas. A pesar de que es posible trasplantar células tumorales de un pez a otro sub-letales de la irradiación de los animales receptores, la regeneración del sistema inmunológico después de 21 días a menudo causa la regresión del tumor 5. La reciente creación de pez cebra singénico ha facilitado en gran medida los estudios tumor trasplante 6-8. Debido a que estos animales son genéticamente idénticos, se implantan las células del tumor trasplantado con firmeza en los peces receptores, y el crecimiento del tumor se puede controlar durante largos períodos de tiempo. Singénico pez cebra es ideal para limitar los ensayos de dilución en el trasplante de células tumorales que no tienen que adaptarse al crecimiento en un microambiente extranjeros, lo que puede subestimar la auto-renovación de la frecuencia de 9 celdas, 10. Además, una trasplantes de células se han completado con éxito el uso de pez cebra singénico 8 y varios cientos de animales puede ser fácil y económicamente trasplantados al mismo tiempo, los cuales sirven para proporcionar una estimación más precisa de la auto-renovación de la frecuencia de la célula.
Aquí, se presenta un método para la creación de primaria, con fluorescencia marcado de células T leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) en el pez cebra singénico, y el trasplante de estos tumores en la limitación de dilución en los peces adultos para determinar la frecuencia de auto-renovación celular. Mientras que la leucemia se presenta como un ejemplo, este protocolo es adecuado para determinar la frecuencia de los tumores se propagan las células utilizando cualquier modelo de cáncer en el pez cebra.
Una de las principales de la utilización del pez cebra en la investigación del cáncer es que un gran número de animales se pueden utilizar a un costo relativamente bajo. Esto es especialmente importante en la limitación de los ensayos de dilución de trasplante de células, donde las proporciones de los animales trasplantados que desarrollan tumores en el número total de trasplantados se utilizan para determinar iniciadoras del tumor de células de frecuencia. En el método que aquí se presenta, más de 70 animales receptores de trasplante se utilizan por ensayo, proporcionando una estimación precisa del número de células tumorales se propagan. Tanto el número de animales utilizados y las dosis de las células tumorales trasplantadas deben ser optimizados para un modelo de cáncer dado, por ejemplo, si los experimentos iniciales muestran iniciadoras del tumor las células son poco frecuentes, las dosis pueden ser útiles trasplante de 100.000, 50.000, 10.000 y 1.000 células por trasplante.
Singénico cepas de pez cebra son útiles para limitar el análisis de dilución. Sin embargo, estas cepas no son todavía de uso común en todos los laboratorios, y algunos modelos de cáncer de pez cebra existen sólo en el pescado alogénico. Limitar trasplantes de células de dilución se puede realizar en las cepas salvajes que han sufrido la ablación inmune, aunque la frecuencia de auto-renovación de células se puede calcular como 10 a 100 veces mayor que si singénico pez cebra se utilizaron 8. Es importante tener en cuenta que una mayor dosis de células deben ser utilizados para trasplantes en receptores no inmunes encontrados, irradiado, ya que algunas células del tumor no va a sobrevivir el trasplante en un micro exterior. Además, muchos tumores comenzará a regresar después de 21 días, cuando el sistema inmune del animal receptor se recupera, por lo que los animales deben ser evaluados para el crecimiento del tumor cada 7 días después del trasplante.
Los métodos presentados aquí son adecuadas para su uso con cualquier modelo de cáncer de pez cebra, y hasta ahora han sido utilizados para determinar iniciadoras del tumor de células, tanto en la frecuencia de células T leucemia linfoblástica aguda, 8, y un modelo de tumor sólido, rabdomiosarcoma 16. Estos tumores fueron etiquetados con fluorescencia mediante la co-inyección de embriones con ambos un oncogen y un marcador fluorescente, ya que el ADN co-segrega, los celulares que expresan el oncogén también expresan la proteína fluorescente 17. Mientras que la fluorescencia es recomendable porque facilita el seguimiento del crecimiento del tumor sin necesidad de sacrificar al animal y provee una forma recta hacia adelante para aislar las células tumorales mediante FACS, es posible marcar a las células tumorales con anticuerpos específicos de tumores fabricantes para facilitar su purificación , aunque la tinción de anticuerpos en el pez cebra puede requerir de optimización.
Finalmente, una vez que la incidencia del tumor de células de propagación se ha determinado para un tipo de tumor determinado, es posible utilizar estas pruebas para identificar los mecanismos que gobiernan la frecuencia de la célula. Por ejemplo, células tumorales primarias pueden ser tratados con inhibidores de la vía específica antes de limitar la dilución del trasplante, trasplantados o los peces se pueden dosificar con las drogas. Además, la genética de los tumores se pueden manipular mediante la inyección de los peces de una etapa de células con un gen de interés, de modo que los tumores primarios resultantes se sobre-expresan el gen. En estos experimentos, ningún efecto sobre la frecuencia de auto-renovación de células se observaron en los ensayos de dilución límite.
The authors have nothing to disclose.
La financiación ha sido proporcionada por las subvenciones del NIH 5T32CA09216-26 (la ACC), y K01 AR055619-01A1 y 3 K01 AR055619-03S1 (por DML), así como por el stand de la Fundación de limonada de Alex, el Harvard Stem Cell Institute y la American Cancer la sociedad.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
Syngeneic zebrafish | References6-8 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |