Grenzverdünnung Zelltransplantation Assays werden benutzt, um die Häufigkeit des Tumor-Ausbreitung Zellen zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von syngenen Zebrafisch, dass fluoreszenzmarkierten Leukämie und Details, wie zu isolieren und zu verpflanzen diesen Leukämiezellen bei Grenzverdünnung in die Bauchhöhle von erwachsenen Zebrafisch zu entwickeln.
Self-Erneuerung Krebszellen sind die einzigen Zelltypen innerhalb eines Tumors, der eine unbegrenzte Fähigkeit, das Tumorwachstum zu fördern, und sind damit als Tumor-Ausbreitung Zellen oder Tumor-initiierende Zellen bezeichnet. Es wird vermutet, dass die Konzentration dieser sich selbst erneuernden Zellen für die Zerstörung wird Tumorprogression Block und stoppen Rückfall, erheblich verbessert Prognose der Patienten 1. Der häufigste Weg, um die Häufigkeit der Bestimmung selbst erneuernden Zellen innerhalb eines Tumors ist eine Grenzverdünnung Zelltransplantation Assay, in dem Tumorzellen in Empfängertiere bei steigenden Dosen transplantiert werden, der Anteil der Tiere, die Tumoren zu entwickeln wird die Berechnung der Anzahl der sich selbst erneuernden Zellen innerhalb des ursprünglichen Tumors Probe 2, 3. Im Idealfall würde eine große Zahl der Tiere in jeder Grenzverdünnung Experiment verwendet werden, um eine genaue Bestimmung der Häufigkeit von Tumor-Ausbreitung Zellen. Allerdings sind in großem Maßstab Experimenten mit Mäusen teuer, und die meisten Grenzverdünnung Assays verwenden nur 10-15 Mäuse pro Experiment.
Zebrafische haben Bedeutung als Krebs-Modell gewonnen, zum großen Teil durch ihre einfache genetische Manipulation und die Wirtschaft durch die breit angelegte Erprobung durchgeführt werden können. Darüber hinaus haben die Krebsarten in Zebrafisch-Modell gefunden worden, um genau imitieren ihr Gegenstück menschlicher Erkrankungen 4. Während es möglich ist, Tumorzellen von einem Fisch zum anderen durch sub-letalen Bestrahlung des Empfängers Tiere, die Regeneration des Immunsystems nach 21 Tagen Transplantation häufig zu Tumorregression 5. Die jüngste Kreation von syngenen Zebrafisch hat erheblich erleichtert Tumortransplantation Studien 6-8. Da diese Tiere genetisch identisch sind, transplantiert Tumorzellen einprägen robust in Empfänger Fisch, und das Tumorwachstum kann über längere Zeit überwacht werden. Syngenen Zebrafisch sind ideal für Grenzverdünnung Transplantation Assays in die Tumorzellen müssen nicht um das Wachstum in einem fremden Mikroumgebung, die sich selbst erneuernden Zellen Frequenz 9, 10 unterschätzen angepasst werden können. Zusätzlich ein Zelltransplantaten wurden erfolgreich abgeschlossen mit syngenen Zebrafisch 8 und mehrere hundert Tiere können einfach und kostengünstig auf einmal transplantiert werden, die beide um eine genauere Schätzung der sich selbst erneuernden Zellen Frequenz sorgen dienen.
Hier wird eine Methode zum Erstellen primärer, fluoreszenzmarkierten T-Zell akuter lymphatischer Leukämie (T-ALL) in syngenen Zebrafisch und Transplantation dieser Tumoren bei Grenzverdünnung zu erwachsenen Fische selbst erneuernden Zellen Frequenz bestimmen, vorgestellt. Während Leukämie als Beispiel vorgesehen ist, ist dieses Protokoll geeignet, um die Häufigkeit der Tumor-Ausbreitung Zellen mit jeder Krebs-Modell in der Zebrafisch zu bestimmen.
Eine wesentliche Stärke der Verwendung von Zebrafisch in der Krebsforschung ist, dass eine große Zahl von Tieren mit relativ geringem Aufwand genutzt werden kann. Dies ist besonders wichtig in Grenzverdünnung Zelltransplantation Assays, in denen der Anteil der transplantierten Tieren, die Tumoren zu entwickeln, um die Gesamtzahl transplantiert verwendet werden, um Tumor-initiierende Zellen Frequenz zu bestimmen. In dem hier vorgestellten Verfahren sind über 70 Transplantatempfängers Tiere pro Test verwendet und bietet eine genaue Schätzung der Tumor-Ausbreitung Zellzahl. Sowohl die Anzahl der verwendeten Tiere und die Dosen von Tumorzellen transplantiert auf eine bestimmte Krebsart Modell sollte optimiert werden, zum Beispiel, wenn erste Versuche Tumor-initiierende Zellen sind selten zeigen, kann nützlich Transplantation Dosen 100.000, 50.000, 10.000 und 1.000 Zellen pro werden Transplantation.
Syngenen Zebrafisch-Stämme sind nützlich in Grenzverdünnung Analyse. Allerdings sind diese Stämme noch nicht allgemein in allen Laboren verwendet, und einige Zebrafisch Krebs Modelle gibt es nur in allogenen Fisch. Grenzverdünnung zelltransplantationen kann in Wildtyp-Stämmen, die immun Ablation unterzogen haben durchgeführt werden, obwohl der sich selbst erneuernden Zellen Frequenz von 10 bis 100-fach höher als bei syngenen Zebrafisch wurden 8 verwendet berechnet werden kann. Es ist wichtig zu beachten, dass größere Dosen von Zellen für Transplantationen in nicht-immune abgestimmt, bestrahlte Empfänger verwendet werden soll, wie manche Tumorzellen nicht überleben wird Transplantation in eine fremde Mikroumgebung. Darüber hinaus werden viele Tumoren beginnen, nach 21 Tagen, wenn der Empfänger Tier, das Immunsystem erholt sich zurückbilden, so Tiere sollten für das Tumorwachstum alle 7 Tage nach der Transplantation beurteilt werden.
Die hier vorgestellten Methoden eignen sich für den Einsatz mit jedem Zebrafisch Krebs-Modell und wurde bisher noch nicht verwendet, um festzustellen, Tumor-initiierende Zellen Frequenz in den beiden T-Zell akute lymphatische Leukämie 8 und einen soliden Tumor-Modell, Rhabdomyosarkom 16. Diese Tumoren wurden Fluoreszenz durch Co-Injektion von Embryonen mit beiden ein Onkogen und fluoreszierenden Marker markiert, weil die DNA co-trennt, jede Zelle, die das Onkogen wird auch zum Ausdruck des fluoreszierenden Proteins 17. Während Fluoreszenz wird empfohlen, weil es Verfolgung von Tumorwachstum, ohne die Notwendigkeit, die Tieropfer erleichtert und bietet eine unkomplizierte Möglichkeit, Tumorzellen durch FACS zu isolieren, ist es möglich, Tumorzellen mit Antikörpern gegen Tumor-spezifische Entscheidungsträger Label, um ihre Reinigung zu erleichtern , kann aber Antikörper-Färbung in Zebrafisch erfordern Optimierung.
Schließlich, nachdem die Häufigkeit von Tumor-Zellen propagieren für eine bestimmte Tumorart bestimmt worden ist, ist es möglich, diese Tests verwenden, um die Mechanismen, die ihre Zelle Frequenz regeln zu identifizieren. Zum Beispiel können primäre Tumorzellen mit Bahn spezifische Inhibitoren vor Grenzverdünnung Transplantation oder transplantiert Fische selbst mit Medikamenten verabreicht werden kann, behandelt werden. Darüber hinaus kann die Genetik der Tumoren selbst durch Injektion des one-Zell-Stadium Fisch mit einem Gen von Interesse manipuliert werden, so dass die resultierende primäre Tumoren überexprimieren des Gens. In diesen Experimenten wird keine Auswirkungen auf sich selbst erneuernden Zellen Frequenz im Grenzverdünnung Assays beobachtet werden.
The authors have nothing to disclose.
Die Finanzierung wurde von NIH gewährt 5T32CA09216-26 (GKI) und K01 AR055619-01A1 und 3 K01 AR055619-03S1 (für DML) sowie von der Alex 'Lemonade Stand-Stiftung, der Harvard Stem Cell Institute und der American Cancer bereitgestellt Society.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
Syngeneic zebrafish | References6-8 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |