Beperkende verdunning celtransplantatie assays worden gebruikt om de frequentie van de tumor voortplantende cellen te bepalen. Dit protocol beschrijft een methode voor het genereren van syngene zebravis dat fluorescent-gelabeld leukemie en details over hoe te isoleren en deze leukemie cellen transplantatie op het beperken van verdunning in de buikholte van de volwassen zebravissen ontwikkelen.
Zelfvernieuwende kankercellen zijn de enige soorten cellen in een tumor die een onbeperkte mogelijkheid om de tumorgroei te bevorderen hebben, en zijn dus bekend als tumor-cellen verspreiden, of tumor-cellen initiëren. Er wordt gedacht dat behoeve van deze zelf-vernieuwing cellen voor vernietiging zal progressie van de tumor te blokkeren en te stoppen terugval, sterk verbeteren van de patiënt een prognose. De meest voorkomende manier om de frequentie te bepalen van zelf-vernieuwing cellen in een tumor is een beperkende verdunning cel transplantatie assay, waarbij tumorcellen worden in de ontvanger dieren getransplanteerd bij hogere doseringen, het aandeel van dieren dat tumoren te ontwikkelen is de gebruikte berekenen van het aantal van zelf-vernieuwing cellen in de oorspronkelijke tumor steekproef 2, 3. Idealiter zou een groot aantal dieren worden gebruikt in elke beperkende verdunning experiment om nauwkeurig bepalen van de frequentie van de tumor voortplantende cellen. Echter, op grote schaal experimenten met muizen zijn kostbaar, en de meest beperkende verdunning assays gebruiken slechts 10-15 muizen per experiment.
Zebravis hebben opgedaan bekendheid als een kanker model, voor een groot deel te wijten aan hun gemak van genetische manipulatie en de economie door die grootschalige experimenten kunnen worden uitgevoerd. Daarnaast zijn de vormen van kanker gemodelleerd in zebravis is gevonden om nauw samen te bootsen hun tegenhanger ziekte bij de mens 4. Hoewel het mogelijk is om de tumorcellen van de ene vis naar de andere transplanteren van sub-dodelijke bestraling van de ontvanger dieren, de regeneratie van het immuunsysteem na 21 dagen veroorzaakt vaak tumorregressie 5. De recente oprichting van syngene zebravis is aanzienlijk vergemakkelijkt tumor transplantatie studies 6-8. Omdat deze dieren zijn genetisch identiek, getransplanteerde tumorcellen inenten robuust in de ontvanger vis, en de groei van de tumor kan worden gevolgd gedurende een lange periode van tijd. Syngene zebravissen zijn ideaal voor het beperken van verdunning transplantatie assays in dat tumorcellen niet moeten aanpassen aan de groei in een vreemde micro-omgeving, die zichzelf vernieuwen celfrequentie 9, 10 mei onderschatten. Bovendien, een-cel transplantatie zijn met succes afgerond met behulp van zebravis syngene 8 en een paar honderd dieren kunnen gemakkelijk en economisch worden getransplanteerd in een keer, die beide dienen om een meer nauwkeurige schatting van de zelf-vernieuwing cel frequentie te geven.
Hier wordt een methode gepresenteerd voor het maken van primaire, fluorescent-gelabelde T-cel acute lymfatische leukemie (T-ALL) in syngene zebravis, en het transplanteren van deze tumoren op het beperken van verdunning in volwassen vissen om zichzelf te vernieuwen cel frequentie te bepalen. Terwijl de leukemie wordt geleverd als een voorbeeld, dit protocol is geschikt om de frequentie van de tumor voortplantende cellen met behulp van welke vorm van kanker model in de zebravis te bepalen.
Een belangrijke kracht van de met behulp van zebravis in het kankeronderzoek is dat grote aantallen dieren kunnen worden gebruikt tegen relatief lage kosten. Dit is vooral belangrijk in het beperken van verdunning celtransplantatie assays, waarbij de verhoudingen van de getransplanteerde dieren dat tumoren te ontwikkelen om de getransplanteerde totale aantal worden gebruikt om de tumor-initiëren cel frequentie te bepalen. In de hier gepresenteerde methode, zijn meer dan 70 transplantatie ontvanger gebruikte dieren per test, die een nauwkeurige schatting van tumor-propageren van het aantal cellen. Zowel het aantal gebruikte dieren en de dosering van getransplanteerde tumorcellen moet worden geoptimaliseerd voor een bepaald type kanker model, bijvoorbeeld als de eerste experimenten tonen aan tumor-cellen initiëren zeldzaam zijn, kan nuttig transplantatie doses 100.000, 50.000, 10.000 en 1.000 cellen per transplantatie.
Syngene zebravis stammen zijn nuttig in het beperken van verdunning analyse. Echter, deze stammen nog niet vaak gebruikt in alle laboratoria, en sommige zebravis kanker modellen bestaan alleen in allogene vissen. Beperkende verdunning cel transplantaties kunnen worden uitgevoerd in wild-type stammen die hebben ondergaan immuun ablatie, hoewel de zelfvernieuwende cel frequentie kan worden berekend als 10 tot 100 maal hoger dan wanneer syngene zebravis werden gebruikt 8. Het is belangrijk op te merken dat een grotere doses van de cellen moet worden gebruikt voor transplantaties in niet-immune afgestemd, bestraald ontvangers, zoals sommige tumorcellen wordt niet transplantatie overleven in een buitenlandse micro-omgeving. Daarnaast zullen vele tumoren beginnen te regressie na 21 dagen wanneer de ontvanger dier het immuunsysteem zich herstelt, zodat de dieren moeten worden beoordeeld voor de groei van de tumor om de 7 dagen na de transplantatie.
De methoden hier gepresenteerde zijn geschikt voor gebruik met zebravissen kanker model, en zijn tot nu toe gebruikt om te bepalen tumor-initiëren cel frequentie in zowel de T-cel acute lymfatische leukemie 8, en een solide tumor model, rhabdomyosarcoom 16. Deze tumoren werden fluorescent gelabelde door co-injectie van embryo's met zowel een oncogen en fluorescerende marker, omdat het DNA co-scheidt, elke cel de uiting van de oncogen zal ook uiten het fluorescerende eiwit 17. Terwijl de fluorescentie is aan te bevelen omdat het vergemakkelijkt het volgen van de groei van de tumor, zonder de noodzaak om het dier te offeren en biedt een straight-forward manier om de tumorcellen te isoleren door FACS, is het mogelijk om tumorcellen label met antilichamen tegen tumor-specifieke beleidsmakers om hun reiniging te vergemakkelijken , kan al antilichaam kleuring in zebravissen nodig optimalisatie.
Tot slot, wanneer de incidentie van tumor-cellen verspreiden is bepaald voor een bepaalde type tumor, is het mogelijk om deze assays gebruiken om de mechanismen die hun cel frequentie bepalen te identificeren. Bijvoorbeeld, kan de primaire tumor cellen worden behandeld met pad specifieke remmers voor beperkende verdunning transplantatie, of getransplanteerd vis zelf kunnen gedoseerd worden met drugs. Daarnaast kan de genetica van de tumoren zelf worden gemanipuleerd door het injecteren van de een-cellig stadium vis met een gen van belang, zodat de resulterende primaire tumoren zal het gen over-express. In deze experimenten, zal geen effect op zelf-vernieuwing cel frequentie worden waargenomen in de beperkende verdunning assays.
The authors have nothing to disclose.
De financiering is verstrekt door NIH subsidie 5T32CA09216-26 (voor het GCO), en de K01 AR055619-01A1 en 3 K01 AR055619-03S1 (voor DML), alsook door de Lemonade Alex Stand Foundation, het Harvard Stem Cell Institute en de American Cancer de samenleving.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
Syngeneic zebrafish | References6-8 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |