Summary
Limitare i test di diluizione trapianto di cellule vengono utilizzati per determinare la frequenza di tumore di moltiplicazione delle cellule. Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di zebrafish singenici che sviluppano leucemia fluorescenza-etichettati e dettagli su come isolare e trapianto di queste cellule di leucemia a limitare la diluizione nella cavità peritoneale di zebrafish adulti.
Abstract
Auto-rinnovano le cellule tumorali sono i tipi di cellule solo all'interno di un tumore che hanno una capacità illimitata di promuovere la crescita del tumore, e sono quindi conosciuti come moltiplicazione delle cellule tumorali o le cellule tumorali di origine. Si pensa che gli obiettivi di tali auto-rigenerante per la distruzione delle cellule blocca la progressione del tumore e smettere di recidiva, migliorando notevolmente la prognosi dei pazienti 1. Il modo più comune per determinare la frequenza di auto-rinnovamento delle cellule all'interno di un tumore è la limitazione delle cellule test di diluizione trapianto, in cui vengono trapiantate le cellule tumorali in animali destinatari a dosi crescenti; la percentuale di animali che sviluppano tumori viene utilizzato il calcolare il numero di auto-rinnovamento delle cellule all'interno del campione di tumore originale 2, 3. Idealmente, un gran numero di animali potrebbe essere usato in ogni esperimento diluizione limita a determinare con precisione la frequenza del tumore di moltiplicazione delle cellule. Tuttavia, esperimenti su vasta scala che coinvolgono i topi sono costosi, e più saggi di diluizione che limitano l'uso solo il 10-15 topi per esperimento.
Hanno assunto un rilievo Zebrafish come modello di cancro, in gran parte a causa della loro facilità di manipolazione genetica e l'economia con cui gli esperimenti su larga scala può essere eseguita. Inoltre, i tipi di cancro modellati in zebrafish sono stati trovati per imitare da vicino i loro 4 malattie umane controparte. Mentre è possibile trapiantare cellule tumorali da un pesce a un altro sub-letali radiazioni di animali destinatario, la rigenerazione del sistema immunitario dopo 21 giorni è spesso causa di regressione del tumore 5. La recente creazione di zebrafish singenici ha enormemente facilitato gli studi trapianto di tumore 6-8. Perché questi animali sono geneticamente identici, trapiantato innestare cellule tumorali robustamente in pesci destinatario, e la crescita tumorale può essere monitorato per lunghi periodi di tempo. Singenici zebrafish sono ideali per limitare i test di diluizione in trapianti che le cellule tumorali non devono adattarsi alla crescita in un microambiente straniero, che può sottovalutare e auto-rigenerante frequenza delle cellule 9, 10. Inoltre, un trapianto di cellule sono state completate con successo utilizzando singenici zebrafish 8 e diverse centinaia di animali possono essere facilmente e economicamente trapiantato in una sola volta, entrambi i quali servono a fornire una stima più precisa di auto-rinnovamento delle cellule di frequenza.
Qui viene presentato un metodo per la creazione di primario, fluorescenza marcata con cellule T leucemia acuta linfoblastica (T-ALL) in zebrafish singenici e trapianto questi tumori a limitare la diluizione in pesci adulti per determinare la frequenza di auto-rinnovamento delle cellule. Mentre la leucemia è fornito come esempio, questo protocollo è adatto per determinare la frequenza di tumore di moltiplicazione delle cellule utilizzando qualsiasi modello di cancro nel zebrafish.
Protocol
1. Microiniezione di DNA di embrioni di zebrafish
- Linearizzare RAG2:: cMyc e RAG2:: 11 GFP costruisce DNA da digerire 10μg di ogni plasmide con Noti a 37 ° C durante la notte.
- Fenolo: cloroformio e precipitare i plasmidi, e risospendere in ogni 20μL H 2 O.
- Determinare la concentrazione del DNA eseguendo una diluizione 1:1, 1:5 e 1:10 di ogni plasmide digerito su un 1% gel con 20μL, 10μL e 5μL di alta gamma scala del DNA. Questo tipo di quantificazione è generalmente più preciso di una lettura spettrometro.
- Diluire il DNA di una concentrazione finale di 60ng/μL a 1M di KCl 0,5 X TE per iniezione in CG1-deformazione (o altro ceppo singenici) embrioni di zebrafish con 30ng/μL RAG2:: cMyc + 30ng/μL RAG2:: GFP.
- Le iniezioni devono essere eseguite precedentemente dimostrato come 12, 13. In breve, pesce zebra maschio e femmina sono istituiti in camere di accoppiamento la sera prima iniezione. Il giorno di iniezione, il DNA è caricato nella ago per l'iniezione, la pressione è regolato in modo che una bolla con un diametro di 50 micron viene espulso (30pg DNA), che viene misurata da un micrometrico. Poi, gli embrioni vengono iniettati al unicellulare palco, con il DNA viene iniettato direttamente nella cellula, e non nel tuorlo. Survival of the iniettato CG1 embrioni e larve è generalmente scarsa, e solo il 5% dei pesci con successo incorporare il transgene, quindi,> 600 embrioni deve essere iniettato per garantire che alcuni pesci si sviluppano leucemia.
- Conservare gli embrioni iniettati a 28,5 ° C, e rimuovere gli embrioni morti dopo 24 ore. Gli animali sono poi trasferiti in vasche di grandi dimensioni a 5 giorni di vita e cresciuto come descritto in precedenza 14.
2. Lo screening per la T-ALL primario in larve zebrafish
- Circa 28 giorni dopo l'iniezione, anestetizzare zebrafish larvale aggiungendo 200μL di 4ng / m Tricane-S a 25 ml di acqua pesce sistema in una capsula di Petri.
- Esaminare le larve per lo sviluppo di fluorescenza marcata con T-ALL utilizzando un microscopio a epifluorescenza a 20X di ingrandimento, con una lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione 485/20 530/25 filtro per rilevare la fluorescenza GFP (Figura 1).
- Separare le larve di tumore positivi da quelli negativi. Larve negativi possono essere esaminate in un punto secondo momento, una volta che i tumori possono essere cresciuti più grandi, per garantire che nessun T-ALL pesce positivi sono stati mancati.
- Monitor T-ALL pesce positivo almeno una volta alla settimana utilizzando il microscopio a epifluorescenza per monitorare la crescita tumorale.
3. Isolamento e la purificazione di fluorescenza marcata con cellule leucemiche primarie
- Quando GFP-positive cellule leucemiche hanno superato> 50% degli animali, il sacrificio il pesce con l'aggiunta di 1 ml di 4ng/mL Tricane-S in una capsula di Petri contenente 9 ml di acqua sistema di pesce.
- Mettere il pesce in un nuovo piatto di Petri contenente 1 ml 0.9x PBS con 5% di siero fetale bovino al buffer le cellule. Macerare il pesce con una lama di rasoio, pipetta la miscela di dissociarsi grumi grandi cellule, le cellule passano poi attraverso un filtro di 40μm in un tubo 50ml. Non è necessario dissociare tutti i grumi di tessuto in cellule singole.
- 500μL Pipettare delle cellule in una provetta di polistirolo da 4 ml. Aggiungere 1ml 1mg/mL ioduro di propidio (PI), che etichetta le cellule morte. Vortex, poi mantenere le cellule in ghiaccio.
- Sacrifica una wild-type CG1 pesce, macerare e la tensione nello stesso modo come sopra per raccogliere le cellule normali, che servono come supporto per le cellule tumorali durante transplant.Add 4 ml 5% FBS a 0.9x PBS al tubo 50mL per un totale volume di 5 ml.
- Contare le cellule normali, portare a 3x10 5 cellule / ml in FBS 5% in PBS 0.9x, poi 100μL/well pipetta di una piastra da 96 pozzetti.
- Utilizzando un Sorter fluorescenza cellulare attivato (FACS), sorta GFP positive, le cellule tumorali PI negativo (Figura 2A, B) nella piastra a 96 pozzetti contenenti le cellule del sangue a dosi seguenti: 10 cellule / pozzetto in 48 pozzi, 100 cellule / pozzetto in 24 pozzi, 1000 cellule / pozzetto in 12 pozzi, e 10.000 cellule / pozzetto in 6 pozzi. Inoltre, 10.000 cellule devono essere ordinati in un pozzo senza cellule del sangue normali, e rianalizzati usando FACS per valutare la purezza e la vitalità delle cellule ordinate (Figura 2C).
4. Limitare il trapianto di diluizione in zebrafish adulti
- Agglomerare le cellule centrifugando la piastra a 96 pozzetti a 2000xg per 10 minuti.
- Rimuovere 95μL del supernatante e risospendere le cellule del 5μL rimanenti.
- Tenere un adulto (> 60 giorni di età) singenici zebrafish lato ventrale, e iniettare la sospensione cellulare nella cavità peritoneale, utilizzando un 26G / 2 "micro-siringa. Zebrafish non c'è bisogno di essere anestetizzato prima del trapianto. Tipicamente, 45 pesci sono trapiantati con cellule leucemiche 10, 20 sono trapiantati con 100 celle, 7 sono le cellule trapiantate con 1.000 e 5 pesci sono trapiantati con 10.000 cellule T-ALL.
5. Analisi per determinare la leucemia, l'avvio di frequenza delle cellule
- Circa 28 giorni dopo il trapianto, esaminare il pesce trapiantati con un microscopio epifluoresence usando una lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione 485/20 530/25 filtro per rilevare la fluorescenza GFP. Registrare il numero di pesci positivo per numero totale di pesci iniettato.
- Riesaminare il pesce ogni 14 giorni per un massimo di 90 giorni e registrare il numero di pesci positivo. Quando un tumore positivo pesci diventano moribondo, il sacrificio degli animali da Tricane-S overdose.
- Ingresso i risultati in una tabella, come mostrato nella Figura 3D. Carica i dati nel web-based ELDA (Extreme Analisi diluizione limitazione) software statistici a http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html 15, che utilizza la frequenza di tumori animali positivi e negativi a ogni dose di trapianto per determinare la frequenza di auto-rinnovamento delle cellule leucemiche all'interno del primario di T-ALL.
6. Rappresentante dei risultati:
Microiniezione di DNA in embrioni di pesce singenici si traduce spesso in un basso tasso di sopravvivenza degli embrioni iniettati, con <60% degli embrioni sopravvivere per 24 ore. Inoltre, la sopravvivenza dei pesci iniettato singenici è generalmente scarsa durante lo sviluppo larvale, con spesso <20% sopravvive per 28 giorni. E 'quindi importante iniettare un gran numero di embrioni al fine di creare i pesci transgenici che si svilupperà T-ALL.
A titolo di esempio, CG1 embrioni ceppo sono stati iniettati con RAG2:: cMyc + RAG2:: GFP. I transgeni co-segregano negli embrioni, in modo che ogni cellula che esprime GFP anche esprimere cMyc. Le larve sono stati sottoposti a screening per primario T-ALL dopo 28 giorni (Figura 1). Il lavoro precedente ha mostrato che circa il 5% dei pesci iniettato avrà GFP-positive le cellule T nel loro timo (Figura 1), e il 100% di questi pesci si sviluppano leucemia, come i linfociti T si trasformano 11. Mentre una piccola percentuale di zebrafish può avere una leucemia più avanzato che è molto facile da individuare al giorno 28, la maggior parte solo un GFP-positive timo (Figura 1), per cui le larve devono essere esaminati individualmente sotto forte ingrandimento per garantire che tutti positivi i pesci vengono selezionati. GFP-positive T-ALL cellule supererà> 50% degli animali tra i giorni 45-70.
Nell'esempio fornito, zebrafish sono stati sacrificati a 65 giorni di vita, e le cellule leucemiche sono stati isolati e FACS ordinati per limitare il trapianto di diluizione. Singole cellule che sono state ioduro di propidio negative e GFP-positive (Figura 2) sono stati ordinati in una piastra da 96 pozzetti. Ri-analisi è stato fatto su 10.000 cellule ordinati al fine di valutare la vitalità (idealmente> 95%) e purezza (idealmente> 92%, Figura 2). Trapiantate T-ALLS generalmente nascono prima dei 28 giorni, ma alcuni tumori possono prendere più di 60 giorni di tempo per svilupparsi. In questo esempio, al giorno 28, i tumori prima fase sono stati visti come una zona di cellule GFP-positive nei pressi del sito di iniezione (figura 3B), mentre alcune T-ALLS erano più progredito, avendo ampliato per riempire la cavità peritoneale (Figura 3C) . I dati di limitare la diluizione saggi di trapianto di cellule provenienti da tre diversi primari T-ALLS sono illustrate nella figura 3D. Per questi esperimenti, oltre 220 animali sono stati trapiantati, che può essere facilmente realizzata da una sola persona all'interno di diverse ore. L'analisi dei dati utilizzando il software ELDA ha dimostrato che, in media, 1 in 135 T-ALL cellule sono state auto-rigenerante leucemia di moltiplicazione delle cellule (Figura 3E).
Figura 1 larve Zebrafish iniettato a una cellula palco con straccio:.:-CMyc + straccio::-eGFP sono stati sottoposti a screening per la crescita leucemia primario 28 giorni dopo l'iniezione. Di pesce (*) aveva GFP-positive le cellule T nel timo; questo pesce si svilupperà T-ALL, come i linfociti T si trasformano nel tempo. Questa fase è molto comune al giorno 28. Un pesce (**) aveva un avanzato T-ALL, che si è diffuso nel tessuto molle. I restanti due pesci sono negativi per la crescita del tumore. L'immagine è stata scattata con ingrandimento di 16x.
Figura 2. Fluorescenza marcata T-ALL cellule sono state ordinate da animali malati e utilizzati nel trapianto di cellule limitare test di diluizione. In primo luogo, un cancello è stato elaborato per selezionare celle singole (pannello superiore a sinistra), poi le cellule ioduro di propidio negative vengono selezionate (al centro del pannello a sinistra). Infine, un cancello è stato elaborato per selezionare solo la GFP-positive cellule leucemiche per l'ordinamento (pannello inferiore a sinistra). Cellule ordinati dovrebbero essere rianalizzati per valutare la vitalità e purezza prima del trapianto (pannelli a destra).
Figura 3. Zebrafish sono stati esaminati per la crescita leucemia 28 giorni dopo il trapianto. I pesci sono o tumorali negative (A), hanno un piccolo tumore che cresce al sito di iniezione (B), o hanno una leucemia progredito (C). Le immagini sono state scattate con ingrandimento 7X. Il numero totale di leucemia-positivi pesce per numero totale di pesci trapiantato ad ogni diluizione viene registrata, come in (D). I dati sono immessi nel web-based ELDA programma per calcolare il numero di auto-rinnovamento delle cellule leucemiche e il superiore e inferiore intervallo di confidenza al 95% (E).
Discussion
Un punto di forza di usare zebrafish nella ricerca sul cancro è che un gran numero di animali può essere utilizzato a costi relativamente bassi. Questo è particolarmente importante nel limitare la diluizione test trapianto di cellule, in cui vengono utilizzate le proporzioni degli animali trapiantati che sviluppano i tumori al numero totale trapiantato a determinare tumore iniziare la frequenza delle cellule. Nel metodo qui presentato, oltre 70 animali ricevente di trapianto vengono usati per test, fornendo una stima accurata del numero di tumori di moltiplicazione delle cellule. Sia il numero di animali usati e le dosi delle cellule tumorali trapiantate dovrebbero essere ottimizzati per un modello determinato tipo di tumore, ad esempio, se gli esperimenti iniziali mostrano tumore inizio cellule sono rare, le dosi di trapianto utili possono essere 100.000, 50.000, 10.000 e 1.000 cellule per trapianto.
Singenici ceppi zebrafish sono utili a limitare l'analisi di diluizione. Tuttavia, questi sforzi non sono ancora comunemente utilizzati in tutti i laboratori, e alcuni modelli cancro zebrafish esistono solo nei pesci allogenico. Limitare i trapianti delle cellule di diluizione possono essere eseguite in ceppi wild-type che hanno subito l'ablazione immunitario, anche se l'auto-rinnovamento delle cellule di frequenza può essere calcolata come 1-10 volte superiore se singenici zebrafish sono stati utilizzati 8. E 'importante notare che una maggiore dose di cellule devono essere utilizzati per i trapianti in non immuni abbinati, i destinatari irradiati, come alcune cellule tumorali non sopravvivono trapianto in un microambiente straniero. Inoltre, molti tumori comincia a regredire dopo 21 giorni quando il sistema immunitario dell'animale ricevente recupera, per cui gli animali dovrebbero essere valutati per la crescita del tumore ogni 7 giorni dopo il trapianto.
I metodi qui presentati sono adatti per l'uso con qualsiasi modello di cancro zebrafish, e sono finora stati utilizzati per determinare tumore delle cellule di avviare la frequenza in entrambe le cellule T leucemia linfoblastica acuta 8, e un modello di tumore solido, rabdomiosarcoma 16. Questi tumori sono state marcate da co-iniezione di embrioni sia con un oncogene e marcatore fluorescente, perché il DNA co-segrega, ogni cellula che esprime l'oncogene anche esprimere la proteina fluorescente 17. Mentre la fluorescenza è raccomandato perché facilita il monitoraggio della crescita tumorale, senza la necessità di sacrificare l'animale e fornisce uno straight-forward modo per isolare le cellule tumorali da FACS, è possibile etichettare le cellule tumorali con anticorpi specifici per i responsabili del tumore per facilitare la loro purificazione , anche se colorazione anticorpi in zebrafish può richiedere di ottimizzazione.
Infine, una volta che l'incidenza di tumore di moltiplicazione delle cellule è stata determinata per un dato tipo di tumore, è possibile utilizzare questi test di identificare i meccanismi che regolano la loro frequenza delle cellule. Per esempio, primario cellule tumorali possono essere trattati con inibitori percorso specifico prima di limitare la diluizione trapianto, trapiantati o di pesce si può essere dosato con i farmaci. Inoltre, la genetica degli stessi tumori possono essere manipolati, iniettando il one-cell pesce palco con un gene di interesse, in modo che il tumore primario risulta sovra-esprimere il gene. In questi esperimenti, alcun effetto sulla frequenza di auto-rinnovamento delle cellule saranno osservati nel test di diluizione limitante.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il finanziamento è stato fornito dal NIH 5T32CA09216-26 (per ACC), e K01 AR055619-01A1 e 3 K01 AR055619-03S1 (per DML), così come dai Alex Lemonade Stand della Fondazione, l'Harvard Stem Cell Institute e l'American Cancer società.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 | |
| Phenol:Chloroform | EMD Millipore | 6805-OP | |
| 5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 | |
| High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 | |
| Syngeneic zebrafish | References6-8 | ||
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-036 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| 26G/2" Microsyringe | Hamilton Co | 80366 | |
| 40μm mesh cell strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
- Zhou, B. -B. S. Tumour-initiating cells: challenges and opportunities for anticancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 8, 806-823 (2009).
- Dick, J. E., Bhatia, M., Gan, O., Kapp, U., Wang, J. C. Y. Assay of human stem cells by repopulation of NOD/SCID mice. Stem Cells. 15, 199-207 (1997).
- Bonnefoixa, T., Bonnefoixa, P., Verdiela, P., Sotto, J. -J. Fitting limiting dilution experiments with generalized linear models results in a test of the single-hit Poisson assumption. J Immunol Methods. 194, 113-119 (1996).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).
- Taylor, A. M., Zon, L. I. Zebrafish Tumor Assays: The State of Transplantation. Zebrafish. 6, 339-346 (2009).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protocols. 5, 383-394 (2010).
- Mizgirev, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable Tumor Lines Generated in Clonal Zebrafish. Cancer Research. 66, 3120-3125 (2006).
- Smith, A. C. H. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Kelly, P. N., Dakic, A., Adams, J. M., Nutt, S. L., Strasser, A. Tumor Growth Need Not Be Driven by Rare Cancer Stem Cells. Science. 317, 337-337 (2007).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The Increasing Complexity of the Cancer Stem Cell Paradigm. Science. 324, 1670-1673 (2009).
- Langenau, D. M. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7369-7374 (2004).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. , (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , Edn. 4, University of Oregon Press. (2000).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347, 70-78 (2009).
- Ignatius, M. S. In vivo imaging identifies that myf5+ embryonal rhabdomyosarcoma-propagating cells are dynamically reorganized during tumor growth. , Forthcoming (2010).
- Langenau, D. M. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27, 4242-4248 (2008).
