限界希釈細胞移植アッセイは、腫瘍増殖する細胞の頻度を決定するために使用されます。このプロトコルは、蛍光標識された白血病と成人のゼブラフィッシュの腹腔内に限界希釈法でこれらの白血病細胞を分離して移植する方法の詳細を開発する同系のゼブラフィッシュを生成するための方法を説明します。
自己複製癌細胞は腫瘍の成長を促進するために無限の能力を有する腫瘍内の唯一の細胞型であり、したがって、腫瘍増殖細胞、または腫瘍開始細胞として知られています。それは破壊のためにこれらの自己複製細胞を標的にすることが大幅患者の予後1を改善、腫瘍の進行を阻止し、再発を停止すると考えられている。腫瘍内で自己複製細胞の頻度を決定する最も一般的な方法は、腫瘍細胞を増加させる用量でレシピエント動物に移植されている限界希釈細胞移植アッセイ、であり、腫瘍を開発し、動物の割合は、数を計算するために使用されます元の腫瘍のサンプル2、3内自己複製細胞の。理想的には、動物の多数は、正確に腫瘍増殖する細胞の頻度を決定するために、各限界希釈実験に使用されます。しかし、マウスを含む大規模な実験は、高価であり、そしてほとんどの限界希釈アッセイは、実験ごとに10〜15マウスを使用してください。
ゼブラフィッシュは、それらの遺伝子操作の容易さと大規模な実験を実行できるようにするための経済のために大部分は、癌のモデルとして注目を得ています。さらに、ゼブラフィッシュでモデル化されたがんの種類は、密接に、相手の人間の病気4を模倣することが判明している。それは、レシピエント動物の致死照射して、1つの魚から別の腫瘍細胞を移植することは可能ですが、21日後の免疫システムの再生には、多くの場合、腫瘍の退縮5を引き起こします。同系ゼブラフィッシュの最近の作成 が大幅に腫瘍移植の研究6-8を促進してきた。これらの動物は、遺伝的に同一、移植腫瘍細胞であるため、レシピエントの魚、および腫瘍の成長に確実に生着は、長期間にわたって監視することができます。同系のゼブラフィッシュは、自己再生細胞の周波数9、10を過小評価することが外国の微小環境で成長、に適応する必要がない腫瘍細胞に希釈移植アッセイを制限するために最適です。また、1セルの移植は成功し自己複製細胞頻度のより正確な見積もりを提供するために役立つ、どちらも同系ゼブラフィッシュ8および数百の動物が容易にかつ経済的に一度に移植することができますが、使用して完了しています。
ここで、メソッドは、同系のゼブラフィッシュの主要な、蛍光標識したT細胞急性リンパ芽球性白血病を(T – ALL)の作成、および自己複製細胞の頻度を決定するために、成魚に限界希釈法でこれらの腫瘍を移植するために提示されます。白血病は、例として提供されていますが、このプロトコルは、ゼブラフィッシュのすべてのがんモデルを用いて腫瘍増殖細胞の頻度を決定するために適しています。
がん研究にゼブラフィッシュを用いての主な強みは、動物の多数は、比較的低コストで使用できることです。これは移植総数に腫瘍を開発、移植動物の割合は腫瘍開始細胞の頻度を決定するために使用される希釈細胞移植アッセイを、制限することで特に重要です。ここで紹介した方法では、70以上の移植のレシピエント動物が腫瘍増殖細胞数の正確な推定値を提供する、アッセイごとに使用されています。使用する動物の数と移植腫瘍細胞の投与量の両方が与え癌モデル用に最適化されるべきである、例えば、初期の実験では腫瘍開始細胞はまれである示している場合、有用な移植の投与量は100,000、50,000、10,000と1,000の細胞かもしれない移植。
同系のゼブラフィッシュの株は希釈分析を制限するのに有用である。しかし、これらの株はまだ一般的に、すべてのラボで使用されていない、といくつかのゼブラフィッシュ癌モデルは、同種の魚にのみ存在します。自己複製細胞頻度が同系のゼブラフィッシュは8を使用した場合よりも10〜100倍高いとして計算されることがありますが、限界希釈細胞移植は、免疫アブレーションを受けた野生型株で行うことができます。いくつかの腫瘍細胞は、外国の微小環境に移植には耐えられないので、細胞の大きな用量は、非免疫整合、照射された受信者への移植のために使用されるべきであることに注意することは重要です。さらに、多くの腫瘍は、レシピエント動物の免疫系が回復21日後に退縮し始めるので、動物は7日毎に移植後の腫瘍の成長のために評価すべきである。
ここで紹介する方法は任意のゼブラフィッシュ癌モデルでの使用に適しており、これまでT細胞急性リンパ芽球性白血病8、および固形腫瘍モデル、横紋筋肉腫16の両方で、セルの周波数を腫瘍開始を決定するために使用されています。これらの腫瘍は、蛍光癌遺伝子と蛍光マーカーの両方を持つ胚の同時注入によって標識した、DNA共偏析するため、癌遺伝子を発現している任意のセルには、蛍光タンパク質17を発現するであろう。それは動物を犠牲にすることなく腫瘍の増殖の追跡を容易にし、FACSによって腫瘍細胞を単離するために直接的な方法を提供するため、蛍光が推奨されますが、それは彼らの精製を容易にするための腫瘍特異メーカーに対する抗体で、腫瘍細胞を標識することが可能です。 、ゼブラフィッシュにおいても抗体の染色は、最適化が必要な場合があります。
最後に、一度腫瘍増殖細胞の発生率が特定の腫瘍タイプに対して決定された、それらの細胞の頻度を支配するメカニズムを識別するために、これらのアッセイを使用することが可能です。例えば、原発腫瘍の細胞は、希釈の移植、または移植された魚を制限する前に経路特異的阻害剤で治療することができます自体が薬物を投与することができます。さらに、腫瘍自体の遺伝学は、その結果、原発腫瘍の遺伝子を過剰発現するように、目的の遺伝子を一細胞期の魚を注入することによって操作され得る。これらの実験では、自己複製細胞の頻度には影響は限界希釈アッセイで観察される。
The authors have nothing to disclose.
資金は、NIHの助成金5T32CA09216 – 26(JSB用)、およびK01 AR055619 – 01A1と3 K01 AR055619 – 03S1(DML用)によって、同様にアレックスのレモネードスタンド財団、ハーバード幹細胞研究所とアメリカがんによって提供されています社会。
Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
Syngeneic zebrafish | References6-8 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |