Limitare i test di diluizione trapianto di cellule vengono utilizzati per determinare la frequenza di tumore di moltiplicazione delle cellule. Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di zebrafish singenici che sviluppano leucemia fluorescenza-etichettati e dettagli su come isolare e trapianto di queste cellule di leucemia a limitare la diluizione nella cavità peritoneale di zebrafish adulti.
Auto-rinnovano le cellule tumorali sono i tipi di cellule solo all'interno di un tumore che hanno una capacità illimitata di promuovere la crescita del tumore, e sono quindi conosciuti come moltiplicazione delle cellule tumorali o le cellule tumorali di origine. Si pensa che gli obiettivi di tali auto-rigenerante per la distruzione delle cellule blocca la progressione del tumore e smettere di recidiva, migliorando notevolmente la prognosi dei pazienti 1. Il modo più comune per determinare la frequenza di auto-rinnovamento delle cellule all'interno di un tumore è la limitazione delle cellule test di diluizione trapianto, in cui vengono trapiantate le cellule tumorali in animali destinatari a dosi crescenti; la percentuale di animali che sviluppano tumori viene utilizzato il calcolare il numero di auto-rinnovamento delle cellule all'interno del campione di tumore originale 2, 3. Idealmente, un gran numero di animali potrebbe essere usato in ogni esperimento diluizione limita a determinare con precisione la frequenza del tumore di moltiplicazione delle cellule. Tuttavia, esperimenti su vasta scala che coinvolgono i topi sono costosi, e più saggi di diluizione che limitano l'uso solo il 10-15 topi per esperimento.
Hanno assunto un rilievo Zebrafish come modello di cancro, in gran parte a causa della loro facilità di manipolazione genetica e l'economia con cui gli esperimenti su larga scala può essere eseguita. Inoltre, i tipi di cancro modellati in zebrafish sono stati trovati per imitare da vicino i loro 4 malattie umane controparte. Mentre è possibile trapiantare cellule tumorali da un pesce a un altro sub-letali radiazioni di animali destinatario, la rigenerazione del sistema immunitario dopo 21 giorni è spesso causa di regressione del tumore 5. La recente creazione di zebrafish singenici ha enormemente facilitato gli studi trapianto di tumore 6-8. Perché questi animali sono geneticamente identici, trapiantato innestare cellule tumorali robustamente in pesci destinatario, e la crescita tumorale può essere monitorato per lunghi periodi di tempo. Singenici zebrafish sono ideali per limitare i test di diluizione in trapianti che le cellule tumorali non devono adattarsi alla crescita in un microambiente straniero, che può sottovalutare e auto-rigenerante frequenza delle cellule 9, 10. Inoltre, un trapianto di cellule sono state completate con successo utilizzando singenici zebrafish 8 e diverse centinaia di animali possono essere facilmente e economicamente trapiantato in una sola volta, entrambi i quali servono a fornire una stima più precisa di auto-rinnovamento delle cellule di frequenza.
Qui viene presentato un metodo per la creazione di primario, fluorescenza marcata con cellule T leucemia acuta linfoblastica (T-ALL) in zebrafish singenici e trapianto questi tumori a limitare la diluizione in pesci adulti per determinare la frequenza di auto-rinnovamento delle cellule. Mentre la leucemia è fornito come esempio, questo protocollo è adatto per determinare la frequenza di tumore di moltiplicazione delle cellule utilizzando qualsiasi modello di cancro nel zebrafish.
Un punto di forza di usare zebrafish nella ricerca sul cancro è che un gran numero di animali può essere utilizzato a costi relativamente bassi. Questo è particolarmente importante nel limitare la diluizione test trapianto di cellule, in cui vengono utilizzate le proporzioni degli animali trapiantati che sviluppano i tumori al numero totale trapiantato a determinare tumore iniziare la frequenza delle cellule. Nel metodo qui presentato, oltre 70 animali ricevente di trapianto vengono usati per test, fornendo una stima accurata del numero di tumori di moltiplicazione delle cellule. Sia il numero di animali usati e le dosi delle cellule tumorali trapiantate dovrebbero essere ottimizzati per un modello determinato tipo di tumore, ad esempio, se gli esperimenti iniziali mostrano tumore inizio cellule sono rare, le dosi di trapianto utili possono essere 100.000, 50.000, 10.000 e 1.000 cellule per trapianto.
Singenici ceppi zebrafish sono utili a limitare l'analisi di diluizione. Tuttavia, questi sforzi non sono ancora comunemente utilizzati in tutti i laboratori, e alcuni modelli cancro zebrafish esistono solo nei pesci allogenico. Limitare i trapianti delle cellule di diluizione possono essere eseguite in ceppi wild-type che hanno subito l'ablazione immunitario, anche se l'auto-rinnovamento delle cellule di frequenza può essere calcolata come 1-10 volte superiore se singenici zebrafish sono stati utilizzati 8. E 'importante notare che una maggiore dose di cellule devono essere utilizzati per i trapianti in non immuni abbinati, i destinatari irradiati, come alcune cellule tumorali non sopravvivono trapianto in un microambiente straniero. Inoltre, molti tumori comincia a regredire dopo 21 giorni quando il sistema immunitario dell'animale ricevente recupera, per cui gli animali dovrebbero essere valutati per la crescita del tumore ogni 7 giorni dopo il trapianto.
I metodi qui presentati sono adatti per l'uso con qualsiasi modello di cancro zebrafish, e sono finora stati utilizzati per determinare tumore delle cellule di avviare la frequenza in entrambe le cellule T leucemia linfoblastica acuta 8, e un modello di tumore solido, rabdomiosarcoma 16. Questi tumori sono state marcate da co-iniezione di embrioni sia con un oncogene e marcatore fluorescente, perché il DNA co-segrega, ogni cellula che esprime l'oncogene anche esprimere la proteina fluorescente 17. Mentre la fluorescenza è raccomandato perché facilita il monitoraggio della crescita tumorale, senza la necessità di sacrificare l'animale e fornisce uno straight-forward modo per isolare le cellule tumorali da FACS, è possibile etichettare le cellule tumorali con anticorpi specifici per i responsabili del tumore per facilitare la loro purificazione , anche se colorazione anticorpi in zebrafish può richiedere di ottimizzazione.
Infine, una volta che l'incidenza di tumore di moltiplicazione delle cellule è stata determinata per un dato tipo di tumore, è possibile utilizzare questi test di identificare i meccanismi che regolano la loro frequenza delle cellule. Per esempio, primario cellule tumorali possono essere trattati con inibitori percorso specifico prima di limitare la diluizione trapianto, trapiantati o di pesce si può essere dosato con i farmaci. Inoltre, la genetica degli stessi tumori possono essere manipolati, iniettando il one-cell pesce palco con un gene di interesse, in modo che il tumore primario risulta sovra-esprimere il gene. In questi esperimenti, alcun effetto sulla frequenza di auto-rinnovamento delle cellule saranno osservati nel test di diluizione limitante.
The authors have nothing to disclose.
Il finanziamento è stato fornito dal NIH 5T32CA09216-26 (per ACC), e K01 AR055619-01A1 e 3 K01 AR055619-03S1 (per DML), così come dai Alex Lemonade Stand della Fondazione, l'Harvard Stem Cell Institute e l'American Cancer società.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
Syngeneic zebrafish | References6-8 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |