Limitation des dosages de dilution transplantation de cellules sont utilisées pour déterminer la fréquence des tumeurs des cellules propager. Ce protocole décrit une méthode pour générer le poisson-zèbre syngéniques qui développent une leucémie marqués à la fluorescence et les détails la façon d'isoler et de transplanter ces cellules leucémiques à limiter la dilution dans la cavité péritonéale du poisson zèbre adulte.
Cellules cancéreuses d'auto-renouvellement sont les types de cellules que dans une tumeur qui ont une capacité illimitée de favoriser la croissance tumorale, et sont donc connus que la tumeur se propageant, ou des cellules tumorales initiatrices. On pense que le ciblage de ces cellules auto-renouvellement pour la destruction va bloquer la progression tumorale et l'arrêt des rechutes, améliorant considérablement le pronostic du patient 1. La façon la plus courante pour déterminer la fréquence de l'auto-renouvellement des cellules dans une tumeur est un test de dilution limite transplantation de cellules, dans lesquelles les cellules tumorales sont transplantés dans des animaux receveurs à des doses croissantes, la proportion d'animaux qui développent des tumeurs est utilisée, le calcul du nombre d'auto-renouvellement des cellules au sein de l'échantillon de tumeur d'origine 2, 3. Idéalement, un grand nombre d'animaux seraient utilisés dans chaque expérience de dilution limite pour déterminer avec précision la fréquence des tumeurs des cellules propager. Cependant, des expériences à grande échelle impliquant des souris sont coûteuses, et la plupart des dosages de dilution limite l'utilisation seulement 10-15 souris par expérience.
Le poisson zèbre ont gagné en importance en tant que modèle de cancer, en grande partie à cause de leur facilité de manipulation génétique et de l'économie par des expériences à grande échelle qui peuvent être effectuées. En outre, les types de cancer chez le poisson zèbre modélisés ont été trouvés à l'imitent leurs 4 maladies homologue humain. Bien qu'il soit possible de transplanter des cellules tumorales d'un poisson à un autre en sous-létales d'irradiation des animaux destinataire, la régénération du système immunitaire après 21 jours provoque souvent une régression tumorale 5. La création récente de poisson zèbre syngéniques a grandement facilité les études de transplantation de tumeurs 6-8. Parce que ces animaux sont génétiquement identiques, les cellules tumorales transplantées se greffer robuste en poissons du destinataire, et la croissance tumorale peut être surveillé sur de longues périodes de temps. Syngéniques zebrafish sont idéales pour limiter la dilution dans la transplantation des essais que les cellules tumorales n'ont pas à s'adapter à la croissance dans un microenvironnement étrangers, ce qui peut sous-estimer la fréquence des cellules auto-renouvellement 9, 10. En outre, une transplantation de cellules ont été réalisés avec succès en utilisant le poisson zèbre syngéniques 8 et plusieurs centaines d'animaux peuvent être facilement et économiquement transplanté à un moment, qui tous deux servent à fournir une estimation plus précise de l'auto-renouvellement de fréquence cellulaire.
Ici, une méthode est présentée pour la création de primaire, marqués à la fluorescence des cellules T de leucémie aiguë lymphoblastique (T-ALL) chez le poisson zèbre syngéniques, et la transplantation de ces tumeurs à limiter la dilution dans les poissons adultes pour déterminer la fréquence des cellules auto-renouvellement. Alors que la leucémie est fourni à titre d'exemple, ce protocole est adapté pour déterminer la fréquence des tumeurs des cellules propageant en utilisant n'importe quel modèle de cancer chez le poisson zèbre.
Une des grandes forces de l'utilisation de poissons zèbres de recherche sur le cancer est qu'un grand nombre d'animaux peut être utilisé à un coût relativement faible. Ceci est particulièrement important dans la limitation des essais de dilution transplantation de cellules, où les proportions d'animaux transplantés qui développent des tumeurs au nombre total transplantés sont utilisés pour déterminer la fréquence des tumeurs initier cellule. Dans la méthode présentée ici, plus de 70 animaux receveurs de greffe sont utilisés par test, en fournissant une estimation précise du nombre de cellules de tumeur se propage. Tant le nombre d'animaux utilisés et les doses de cellules tumorales transplantées devraient être optimisés pour un modèle de cancer donné, par exemple, si les premières expériences montrent la tumeur initier les cellules sont rares, les doses peuvent être utiles greffe 100000, 50000, 10000 et 1000 cellules par transplantation.
Syngéniques souches de poisson zèbre sont utiles dans l'analyse de limiter la dilution. Cependant, ces souches ne sont pas encore couramment utilisés dans tous les laboratoires, et certains modèles de cancer zebrafish existent seulement dans les poissons allogènes. Limiter les transplantations de cellules de dilution peut être effectuée dans des souches sauvages qui ont subi l'ablation immunitaire, bien que la fréquence des cellules auto-renouvellement peut être calculé comme 10 à 100 fois plus élevée que si le poisson-zèbre syngéniques ont été utilisés 8. Il est important de noter que des doses de cellules doivent être utilisés pour des transplantations en non-immunes appariés, les destinataires irradiés, comme certaines cellules tumorales ne survivra pas transplanter dans un microenvironnement étrangers. De plus, de nombreuses tumeurs ne commencent à régresser après 21 jours lorsque le système immunitaire de l'animal receveur récupère donc les animaux doivent être évalués pour la croissance tumorale tous les 7 jours après la greffe.
Les méthodes présentées ici sont adaptés pour une utilisation avec n'importe quel modèle de cancer du poisson zèbre, et ont jusqu'à présent été utilisées pour déterminer la fréquence des tumeurs des cellules initier à la fois dans des cellules T leucémie aiguë lymphoblastique 8, et un modèle de tumeur solide, le rhabdomyosarcome 16. Ces tumeurs ont été marqués par fluorescence par co-injection d'embryons à la fois avec un oncogène et de marqueur fluorescent; car l'ADN co-ségrégation, toute cellule exprimant l'oncogène également exprimer la protéine fluorescente 17. Alors que la fluorescence est recommandée car elle facilite le suivi de la croissance tumorale, sans la nécessité de sacrifier l'animal et fournit un moyen straight-forward pour isoler les cellules tumorales par FACS, il est possible d'étiqueter les cellules tumorales avec des anticorps spécifiques de la tumeur décideurs pour faciliter leur purification , coloration des anticorps bien chez le poisson zèbre peut exiger d'optimisation.
Enfin, une fois l'incidence des tumeurs propageant cellules a été déterminée pour un type de tumeur donné, il est possible d'utiliser ces tests pour identifier les mécanismes qui régissent leur fréquence cellulaire. Par exemple, les cellules tumorales primaires peuvent être traités par des inhibiteurs spécifiques voie avant de limiter la dilution de greffe, ou des poissons transplantés eux-mêmes peuvent être dosés avec des médicaments. De plus, la génétique des tumeurs elles-mêmes peuvent être manipulées par l'injection des poissons stade unicellulaire avec un gène d'intérêt, alors que les tumeurs primaires résultant seront sur-expriment le gène. Dans ces expériences, aucun effet sur l'auto-renouvellement des cellules de fréquence sera observée dans les essais de dilution limite.
The authors have nothing to disclose.
Le financement a été fourni par des subventions du NIH 5T32CA09216-26 (pour la JSB), et K01 AR055619-01A1 et 3 K01 AR055619-03S1 (pour DML), ainsi que par la Fondation Alex Lemonade Stand, le Harvard Stem Cell Institute et l'American Cancer Société.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
Syngeneic zebrafish | References6-8 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |