Summary
一个简单的程序，切片，免疫组织化学和激光共聚焦显微镜Corti器的vibratome描述。此过程允许的罚款尔蒂哺乳动物器官的细胞结构的改善保存，因此可以准确定量的细胞类型。
Abstract
尔蒂哺乳动物器官是一个高度有序的mechanosensory头发和nonsensory支持细胞的细胞镶嵌
（在1,2审查）。可视化的这种细胞的马赛克往往需要Corti器的横截面。特别是nonsensory支柱和Deiters细胞，其细胞核位于毛细胞基部，不能无交叉切片Corti器的可视化。然而，细腻尔蒂哺乳动物器官的细胞结构，包括罚款的支柱和Deiters细胞的胞质突起，是难以保持常规病理过程，如石蜡及冷冻切片，这是与标准的免疫组织化学染色技术兼容。
在这里，我描述了一个简单而强大的程序，包括耳蜗，在整个装载这些vibratome部分的免疫组织化学染色，共聚焦显微镜，切片vibratome。这个程序已经广泛用于多个器官，包括鼠标肢芽，斑马鱼肠道，肝，胰，心（见3-6选定的例子）的immunhistochemical分析。此外，此过程成像和quantitificaton支柱细胞在胚胎和成年小鼠7尔蒂突变和控制机关数sucessful。然而，这种方法是目前没有被广泛用来研究哺乳动物器官的尔蒂。在此过程中的潜在的罚款尔蒂成人器官的细胞结构都提供了增强的保存和允许各种细胞类型的量化描述。
Protocol
1。内耳的分离和固定
- 在Corti器的蜂窝图案分析，安乐死适当上演胚胎或成人。
- 解剖奥迪胶囊，含有膜的内耳。鼠标，可以轻松完成对胚胎的胚胎（五）14.5天以上，其中E0.5检测阴道塞的一天。解剖奥迪胶囊是第一个完成斩首和开放的头骨中线。移除大脑揭露每个耳朵（图1A）。内耳可掏出完整的使用镊子（如杜蒙＃5，图1B）。如果成像Corti器，小心去除与奥迪胶囊相关的所有神经细胞和结缔组织是没有必要的。
- 修复整个内耳由4％多聚甲醛浸泡在温和的摇摆（PFA）4 ° C 1.8毫升螺丝帽NUNC小瓶冷冻管，或其他适当大小的容器中过夜。煤灰的解决方案应该是在2 0 DDH取得了新的，然后储存在-20 ° C，直到需要。
- 第二天，洗出三个1X磷酸盐的变化固定液缓冲液（PBS）。组织可存储天至数月，直到准备进行处理，在无菌1X PBS。成人组织，除垢在10％EDTA（0.27 M）在4 ° C为5天，其次是在1X PBS冲洗和存储。
2。切割vibratome节
- 准备在1X PBS 4％低熔点琼脂糖。添加低熔点琼脂糖1X PBS和微波，直到琼脂糖溶液中。该解决方案不泡过的护理 - 利用微波定期和漩涡混合。保持在55℃水浴，直到准备使用的解决方案。
- 使用镊子，取出内耳1X PBS液和一个剥离一个双向嵌入模具的底部的位置。吸取了任何多余的1X PBS从模具。填充模具用大量液体4％低熔点琼脂糖（图2A），以支付组织。
- 内耳切片在适当的平面位置。我已获得逼近奥迪胶囊的位置，如果它一直在原地留在头部，并在横向平面切片Corti器的横截面。 E14.5胚胎到成人，位置，以便它视为横向与外侧的半圆形运河可见（图2B），内耳。角的内耳使奥迪胶囊后形成的线大约是在一个45度角，从切片（图2A，B）的拟平面。当奥迪胶囊被认为奥迪胶囊背部分是在顶部，耳蜗底回应位于底部（箭头，图2b）和前半规管（ASC）在顶部（图2B）。
- 琼脂糖将设置在室温下30分钟内。转移剥走模具含有包埋组织，以4℃，直到准备第。如果切片将被推迟到第二天，加入1X PBS覆盖在模具和存储在一个潮湿的纸毛巾浸泡在1X PBS框琼脂糖。
- 剥离的塑料模具。使用刀片，切出琼脂糖框，其中包含的内耳组织。照顾，以确保截面直和平行块的对面，这将是表面上粘琼脂糖块。由于琼脂糖不渗透的组织，不从周围的组织修剪过多琼脂糖，这样的组织将是很好的支持。
- 使用强力胶块切割面。
- 在第40至100微米的厚度vibratome。与1X PBS，0.1％TritonX - 100填补了组织培养皿中保存的部分。一个有代表性的部分是通过耳蜗螺旋图所示。 2C。
- 使用镊子，解剖远离组织琼脂糖。琼脂糖不会穿透组织，但也只是坚持到内耳的外表面。
- 如果需要，池琼脂糖，切片组织一个大洞的开放使用吸管，以防止组织过度剪切。如果执行多个不同组织的多种抗体的污渍，部分可以在16 - 或24孔组织培养皿举办。
3。抗体染色vibratome部分
继续与抗体染色。在整个安装过程部分，在溶液中自由浮动。下面是一个例子Corti器的支柱细胞S100的标记抗体染色协议，但该协议可以用于任何抗体。除非另有说明，所有的清洗是在室温下进行。
- 在一个多井的组织培养皿中，PBT温和的摇摆（1X PBS，1％的牛血清白蛋白，0.1％Triton X一100）孵育30分钟的自由浮动的部分。
- 吸取关闭旧的解决方案和块自由FLoating节30分钟的温和的摇摆PBT +正常山羊血清（50μL农工商超市，PBT / 1毫升）。
- 吸取关闭旧的解决方案，并添加在PBT +农工商超市（PBT +农工商S100的1:200稀释）稀释抗体。在4℃孵育过夜彗星与温和的摇摆。
- 吸取过初级抗体溶液。洗3倍，5分钟。与PBT，然后4X，30分钟。与PBT。
- 座与PBT +农工商超市，30分钟。
- 孵育与荧光标记的二抗稀释PBT +农工商超市（山羊提出）。孵育过夜，4 ° C，或者几个小时，放疗，温和的摇摆。
- 吸取过二次抗体溶液。洗3倍，5分钟，然后4X，30分钟。与PBT。
- 关闭最后PBT吸取清洗和适当的水安装包含核染液的介质更换。
4。安装在幻灯片上部分和共聚焦显微镜
为了防止盖玻片压碎厚，安装个别路段时，一个间隔必须在显微镜载玻片和盖玻片之间插入。下面是两个替代方法安装厚vibratome部分：
- 在广场周围的组织切片置于真空润滑脂的边缘，可以创建一个间隔。因此，当放下盖玻片，盖玻片边缘将密封的真空润滑脂。按盖玻片边缘用拇指到幻灯片上，坚定不移地坚持它。如果周围盖玻片边缘整齐，均匀，是目前真空润滑脂，幻灯片将被封闭，足够为一个倒置的共聚焦显微镜的使用。
- 另外，可以创建一个间隔使用已知的网目尺寸的琼脂糖层析树脂（如阿菲 - 凝胶蓝胶，Bio - Rad公司）。吸取1μL树脂到每个将被放置盖玻片的四个角落的显微镜幻灯片。吸取之一的组织切片和树脂的四个点中安装媒体。盖玻片。如果使用的是一个倒置的共聚焦显微镜，密封的显微镜玻片上，盖玻片，使用指甲油。
- 获得使用共聚焦显微镜切片染色vibratome的光学部分。为了量化Corti器内的各种细胞类型，在定义的步长（1.5至3微米）获得一个Z - Stack的。部分应该反染核染料（步骤3.8）。共聚焦图像采集后的任何电脑屏幕上的图像可以检查。细胞可以算作手动图像观察原子核的外观和失踪审议通过Z - Stack的顺序。
5。代表性的成果：
一个代表共聚焦的Z - Stack通过vibratome的部分，S100蛋白，这是目前在支柱产业和Deiters细胞，核染色（图3A - F）的counterstained染色。每个小组在3微米的步骤采取的共聚焦图像，与面板的一个共聚焦图像获得最接近vibratome节和面板F的共聚焦图像vibratome节内获得最内部表面。 Corti器的形态出现最小中断。特别是，支柱细胞的细胞质扩展不破。指出，通过在Z - Stack（图3A至3F）的外观和支柱细胞核消失，无论是内部和外部的支柱细胞数量可算（见编号，图3A - F）。由于少数每人共聚焦图像的细胞类型，这种方法可以用来计数Corti器内的大多数细胞类型。
图1。完好，周15岁，成人内耳在奥迪胶囊包裹。 （一）正确的滴耳胶囊（括号内）包裹在颅骨，从内部头部的制高点看，大脑取出后。前路是正确的。 （二）完整，15周龄后，从头骨解剖内耳。左侧内耳侧面可见;右内耳的内侧表面可见。标签表明前半规管（ASC），合作（耳蜗），OW（卵圆窗）的位置。
图2：（一）所有在琼脂糖嵌入在剥离的模具中心，从15周龄成年内耳。拟截面表示。 （b）关闭图像嵌入到前15周龄，整个内耳。周围骨的一部分已被解剖了，所以膜迷路可以更清楚地查看。被跟踪的横向半圆形运河（LSC），前半规管（ASC），和耳蜗（CO）（白色曲线）。耳蜗（箭头）基转，并打算平面部分（虚线）表示。 （三）代表的CROS -通过耳蜗。在一个截面通过人工耳蜗管，尔蒂（OC）的器官是盒装，血管纹（SV）括号内，Reissner变分的膜（RM）表示。
图3。尔蒂在野生型小鼠在P21的器官。 （AF）的顺序焦系列，在3微米步长，通过一个S100抗体染色Corti器，可视化的支柱细胞和Deiters，“细胞。从开始到结束的一系列内部和外部的支柱细胞计数的编号。缩写：IHC（内毛细胞），aIHC（相邻的内毛细胞），OHC（外毛细胞），PC（支柱细胞），DC（Deiters'细胞）。
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Discussion
vibratome切片，免疫组织化学和激光共聚焦成像的过程，允许尔蒂与器官组织的损伤最小的可视化。显然，从内部在vibratome部分地区采取的共聚焦图像显示对细胞的形态，只有通过固定工件有限的优秀保存。接近两个削减了vibratome部分表面的共聚焦图像往往无法区分来自内部区域的图像，虽然偶尔蜂窝中断，如在休息的支柱细胞的细胞质扩展，观察（未显示）。这种方法很简单，主要设备的物品 - 一个vibratome机和激光共聚焦显微镜 - 通用设备项目，一般多数研究者。此外，这种方法可用于任何抗体，显示在Corti器的特殊染色。事实上，这种方法的主要限制因素是抗体的特异性，以及本议定书第3步的修改可能是必要的，以确保一个给定的抗体会导致特异性染色的。总之，我将介绍一个简单的过程，这是任何抗体普及，并确保最大的保护和Corti器细胞组织的分析。
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Disclosures
IACUC威斯康星医学院规定的准则和法规的规定进行了动物实验。
Acknowledgments
笔者想承认儿童研究所成像核心使用共聚焦显微镜和张健博士的建议，安装使用琼脂糖珠的部分。这项工作是由美国国立卫生研究院授予DC010387。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica Microsystems | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences, Inc. | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher Scientific | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
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