Summary

Хроматин Иммунопреципитация из ткани спинного Ganglia Корневая следующие аксональное повреждение

Published: July 20, 2011
doi:

Summary

Мы представляем метод хроматин иммунопреципитации из спинных ганглиев ткани корневой следующие аксонального травмы. Подход может быть использован для определения конкретных сайтов связывания транскрипционных факторов и эпигенетические модификации гистонов и ДНК важны для регенерации аксонов ранения в обоих периферической и центральной нервной системы.

Abstract

Аксоны в центральной нервной системе (ЦНС) не восстанавливаются в то время как в периферической нервной системы (ПНС) не регенерировать в ограниченном объеме после травмы (Дэн и соавт., 2006). Следует признать, что транскрипционный программы необходимы для аксонов и аксонального результатом активизируются после травмы в ПНС (Makwana и соавт., 2005). Однако инструменты, доступные для анализа нейронной регуляции генов в естественных условиях ограничено и часто сложной задачей.

Спинных ганглиев корня (DRG) предлагают отличные модели системы травм, так как ЦНС и ПНС иннервируются раздвоенный аксон происходящей из той же сомы. Ганглии представляют собой дискретные коллекция клеточных тел, где все транскрипционные события происходят, и тем самым обеспечить четкое определение области транскрипционной активности, которые можно легко и воспроизводимо удалены от животного. Повреждение нервных волокон в ПНС (например, седалищного нерва), где аксонального регенерация происходит, должно выявить набор транскрипционных программы, отличные от тех, отвечая на аналогичный травмы в ЦНС, где регенерации не происходит (например, спинного мозга ). Участки для связывания транскрипционных факторов, гистонов и ДНК модификации в результате несчастного случая либо ПНС или ЦНС могут быть охарактеризованы с помощью хроматин иммунопреципитации (чип).

Здесь мы описываем ChIP протокол с использованием фиксированных тканей DRG мыши следующий аксонального травмы. Это мощное сочетание обеспечивает средства для характеристики про-хроматина регенерации среды, необходимой для продвижения аксонального регенерации.

Protocol

1. Седалищный и спинной травмы колонке нерва Животное помещают на хирургическое полотенце и под ним thermopad присутствует на протяжении всей процедуры поддержания температуры тела мыши при 37 ° C. Все животные под наркозом для операции с непрерывным изофлуран / O 2 администрации. …

Discussion

Этот протокол обеспечивает метод прямо спросить о хроматина окружающую среду во время аксонального регенерации нервной системы взрослого следующие аксонального травмы. Она включает в себя модели DRG травмы с хроматином иммунопреципитации для исследования транскрипции и эпигенетиче?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Андреа Тедески за помощью в установлении первоначальных экспериментов чип в лабораторных и Рикко Lindner за вклад для тонкой настройки условий для чип. Эта работа была поддержана фондом Херти; Фортуна Грант, Университет Тюбингена, и DFG DI 1497/1-1 грантов (все предоставляемые Симоне ди Джованни).

Materials

Reagent Company Catalogue number
10x ChIP Buffer Cell Signaling 7008
2x ChIP Elution Buffer Cell Signaling 7009
ChIP Grade Protein G Magnetic Beads Cell Signaling 9006
Magna Grip Rack (8 well) Millipore 20-400
Chloroform MERCK UN 1888
37% Formaldehyde ROTH CP10.1
10x Glycine Solution Cell Signaling 7005
Glycogen Sigma G1767
10x HBSS Gibco 14185
Histone H3 antibody (rabbit) Cell Signaling 2650
Normal Rabbit IgG Cell Signaling 2729
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol ROTH A156.1
Protease Inhibitors Cocktail Tablets Roche 04 693 116 001
Proteinase K (20 mg/ml) Cell Signaling 10012
SDS Lysis Buffer Upstate 20-163
Equipment needed
Sonicator
Micropestle
Microcentrifuge
Thermomixer

References

  1. Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
  2. Carey, M. F. . Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).
  3. Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
  4. Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
  5. Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
  6. Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
  7. Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
  8. Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
  9. Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).

Play Video

Cite This Article
Floriddia, E., Nguyen, T., Di Giovanni, S. Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury. J. Vis. Exp. (53), e2803, doi:10.3791/2803 (2011).

View Video