Summary
Nous présentons une méthode pour immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux après une lésion axonale. L'approche peut être utilisée pour identifier des sites spécifiques facteur de transcription liant et la modification épigénétique de l'importance des histones et l'ADN pour la régénération des axones lésés à la fois dans le système nerveux central et périphérique.
Abstract
Axones dans le système nerveux central (SNC) ne se régénèrent pas, tandis que ceux du système nerveux périphérique (SNP) ne régénère dans une certaine mesure après une blessure (Teng et al., 2006). Il est reconnu que les programmes de transcription essentiels à la croissance des neurites et axonales sont réactivés lors d'une lésion au niveau du SNP (Makwana et al., 2005). Toutefois, les outils disponibles pour analyser la régulation des gènes in vivo des neurones sont limitées et souvent difficiles.
Les ganglions de la racine dorsale (DRG) offrent un système de blessures, car les deux excellents modèle de SNC et du SNP sont innervés par un axone bifurqué provenant du soma mêmes. Les ganglions représentent une collection discrète de corps cellulaires où tous les événements transcriptionnels se produire, et fournir ainsi une région clairement définie de l'activité transcriptionnelle qui peuvent être facilement et de façon reproductible retiré de l'animal. Blessure de fibres nerveuses au niveau du SNP (nerf sciatique par exemple), où la régénération axonale ne se produisent, devraient révéler un ensemble de programmes transcriptionnels qui sont distincts de ceux répondant à une blessure similaire dans le SNC, où la régénération n'a pas lieu (par exemple, la moelle épinière ). Sites pour le facteur de transcription liant, histones et modification de l'ADN résultant d'une blessure à l'autre SNP ou SNC peuvent être caractérisés en utilisant immunoprécipitation de la chromatine (ChIP).
Ici, nous décrivons un protocole puce en utilisant les tissus fixés DRG la souris après une lésion axonale. Cette puissante combinaison fournit un moyen pour caractériser l'environnement chromatine pro-régénération nécessaire pour favoriser la régénération axonale.
Protocol
1. Sciatique et une lésion du nerf dorsal colonne
- L'animal est placé sur une serviette en chirurgie et en dessous une thermopad est présent pendant toute la procédure garder la température du corps de la souris à 37 ° C. Tous les animaux sont anesthésiés à la chirurgie avec une constante isoflurane / O 2 de l'administration. Les instruments chirurgicaux sont autoclavés avant la procédure.
- Pour les dommages sciatique, deux membres postérieurs sont soigneusement rasé, et l'épilation est complété par épilateur génériques avant nettoyage de la peau avec de l'alcool suivie par Betadyne 3 fois.
- Le nerf sciatique est exposée par une incision de 4 mm postérieur et parallèlement au fémur à mi-cuisse à travers la peau et en répartissant les muscles en dehors de l'biceps avec des pinces fines.
- Le nerf sciatique est exposée, puis blessé, et la peau est fermée avec deux clips de suture.
REMARQUE: La même incision est faite pour exposer le nerf sciatique, mais la plaie est suturée fermée laissant intacte le nerf de la blessure imposture.
- Pour des blessures de la colonne dorsale, le dos de la souris est soigneusement rasé, et l'épilation est complété par épilateur génériques avant de nettoyer la peau avec de l'alcool de pulvérisation / glisser.
- La moelle épinière est exposée par une incision de 2,5 cm environ T7 à T13. La peau est écartées, et le tissu conjonctif est enlevée le long de la vertèbre de T9 à T11.
- Une laminectomie est réalisée à T10 niveau
NOTE: Pour la plupart des expériences, la laminectomie est considéré comme la blessure Sham.
- Quelques gouttes de xylocaïne sont ajoutées au tissu pour anesthésier le cordon, et la dure-mère est enlevée, en accordant une attention à ne pas toucher la moelle épinière.
- Les colonnes dorsales sont blessés et le muscle est suturé proches, encore une fois attention à ne pas toucher la moelle épinière. Enfin, la peau est suturée fermé avec des clips de suture. La buprénorphine (0,1 mg / kg) doit être administré deux fois par jour pendant 48 heures ou jusqu'à ce que ne sont plus nécessaires.
2. Réticulation
- Disséquer DRG L4 et L5 de souris blessées après l'euthanasie. Collecter un total de 16 GHM dans glacée HBSS + inhibiteurs de la protéase à cocktails (2 blessés et 2 simulacre DRG de chaque animal, pour un total de 4 animaux).
- Centrifuger brièvement le DRG, puis retirez délicatement le HBSS et ajouter 500 ul de 1% de formaldehyde dans du PBS + cocktail inhibiteurs de la protéase et incuber l'échantillon pendant 30 minutes à 37 ° C.
Étape critique. Utilisez fraîche, le formaldéhyde moléculaires de qualité de biologie.
- Ajouter 125 mM de glycine pour arrêter la fixation et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
- Centrifuger brièvement, aspirer hors de tampon, et lavez le tissu à deux reprises avec 500 ul PBS glacé + cocktail inhibiteurs de la protéase.
3. Préparation de noyaux et de cisaillement chromatine
- Aspirer le PBS, ajouter 400 ul de tampon de lyse SDS, transférer dans un tube à centrifuger pré-réfrigérés, et de perturber le tissu avec environ 30 coups à la micropestle.
Étape critique. Lyse et des perturbations du tissu sont vitales pour un bon rendement de la chromatine réticulé.
- Soniquer l'échantillon avec 8 impulsions, 10 secondes chacun à la sortie de 70% (Bandelin, Sonoplus GM70).
ATTENTION. Le cisaillement de la chromatine doit être optimisé pour votre sonication notamment mis en place et la fragmentation de la chromatine correcte doit être vérifié avant de lancer l'expérimentation IP réelle (voir la section 3).
NOTE. Fragmentation de la chromatine pourrait également être effectuée par micrococcal nucléase (MNase) la digestion. En règle générale, la fragmentation par ultrasons est préféré pour des tissus fixés, tandis que la digestion est favorisée pour MNase immunoprécipitation tissus chromatine native. Réticulé, cisaillé chromatine peuvent être stockés à -80 ° C pendant 2 mois, mais éviter la répétition des cycles gel / dégel.
4. Analyse de la digestion de chromatine (recommandé)
- Retirer 10 ul de votre échantillon cisaillé chromatine pour l'analyse. Ajouter 200 mM de NaCl à l'échantillon et d'inverser le cross-link par une incubation à 65 ° C pendant 2h.
- Purifier l'ADN (voir section 8) et d'exécuter un gel d'agarose 1%. ADN devraient être fragmentée à une longueur d'environ 200-1000 pb (figure 1).
ATTENTION. Plus de la fragmentation de la chromatine peut conduire à de signal diminué, tandis que la fragmentation incomplète conduira à la résolution diminuée et le fond a augmenté.
5. Immunoprécipitation
- Déterminer le nombre de réactions d'immunoprécipitation (voir note ci-dessous), et diviser des échantillons aussi dans de nouveaux tubes. Porter le volume de chaquejusqu'à 500 ul avec un tampon de puce + inhibiteurs de la protéase cocktail.
- Retirer 5 ul de votre échantillon dilué et le transfert dans un nouveau tube. Ceci est votre échantillon d'entrée de 1% et il sera stocké à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire (article 7).
- Pour chaque immunoprécipitation, ajouter des anticorps appropriés ou IgG normales de contrôle et incuber à 4 ° C pendant la nuit avec la rotation.
NOTE. Lors de la détermination du nombre d'immunoprécipitation, un contrôle positif (par exemple des anticorps histone H3) et un contrôle négatif (IgG normale) doit être envisagée. La quantité d'anticorps utilisés pour chaque IP varie entre anticorps et doit être déterminée empiriquement. Cependant, il est généralement dans une fourchette de 2-10? G / immunoprécipitation.
- Pour votre immunoprécipiter anticorps / protéine / ADN complexes, ajouter 30 ul de ChIP grade Perles protéines G magnétique et incuber pendant 2 h à 4 ° C avec rotation.
6. Lavage
- Pour déroulant liés chromatine perles complexes, placer le tube sur le support magnétique. Attendez jusqu'à ce que la solution est claire et ensuite retirer soigneusement votre surnageant.
- Ajouter 1 ml de lavage faible teneur en sel (tampon ChIP) pour les perles et incuber à 4 ° C pendant 3-5 minutes avec une rotation, puis tirez vers le bas perles et aspirer hors laver comme à l'étape 6.1. Répétez cette étape pour un total de 3 lavages.
- Ajouter 1 ml de tampon de lavage élevées de sel (tampon puce + 350 mM NaCl) pour les perles et incuber pendant 3-5 minutes avec une rotation, puis tirez vers le bas perles et aspirer hors laver comme à l'étape 6.1.
7. Élution et le renversement de réticulation
- Prenez vos échantillons d'entrée de la -20 ° C, ajouter 150 ul de tampon d'élution ChIP et mis de côté à température ambiante jusqu'à l'étape 7.5.
- Ajouter 150 pi de tampon d'élution ChIP 1x pour chaque échantillon IP de l'étape 6.3.
- Placer les tubes dans un thermomixer et éluer la chromatine des billes en incubant les échantillons à 65 ° C pendant 30 minutes avec vortex doux.
- Pull-down des perles sur le rack magnétique, et transférer soigneusement la chromatine éluée (surnageant) dans de nouveaux tubes.
- Pour tous les tubes, y compris vos échantillons d'entrée, ajouter 200 mM de NaCl et 40 ug / réaction de la protéinase K et incuber à 65 ° C pendant 2 heures.
NOTE. L'étape d'élution peut être effectuée à température ambiante, aussi, mais il pourrait ne pas être aussi efficace.
8. Récupération de l'ADN
- Ajouter 1 volume de phénol / chloroforme à vos échantillons provenant de l'étape 7.5 et vortex pendant 30 secondes.
- Centrifuger à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse à température ambiante pendant 5 minutes.
- Soigneusement récupérer les aqueuse (supérieure) de phase dans de nouveaux tubes, ajouter 1 volume de chloroforme à la phase aqueuse, et le vortex pendant 30 secondes.
- Centrifuger à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse à température ambiante pendant 5 minutes.
- Soigneusement récupérer les aqueuse (supérieure) de phase dans de nouveaux tubes, puis ajouter 300mm de NaOAc, 20 ug / réaction du glycogène, et 2,5 volumes d'éthanol glacé de 100%.
ATTENTION. L'ajout d'un transporteur, comme le glycogène, est nécessaire pour améliorer la précipitation de relativement petite taille des fragments d'ADN.
- Incuber à -80 ° C pendant 2 heures pour précipiter l'ADN.
NOTE. L'étape de précipitation peut aussi être effectuée durant la nuit à -20 ° C.
- Centrifuger les échantillons à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse pendant 20 minutes à 4 ° C.
- Retirer délicatement le surnageant et laver les culots d'ADN précipité avec 300 pi de la glace froide d'éthanol à 70%.
- Centrifuger les échantillons à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse pendant 10 minutes à 4 ° C.
- Retirer délicatement le surnageant que possible et laisser les granulés séchés à l'air.
- Remettre en suspension dans 20 pl de stériles H 2 O. Les échantillons sont maintenant prêts pour la PCR, ou l'ADN peuvent être conservés à -20 ° C.
9. Les résultats représentatifs
Un résultat représentatif d'une expérience de ChIP dans les GHM suivants lésion sciatique est montré (figures 1 et 2). Premièrement, nous montrons l'ADN fragmenté à une longueur d'environ 200-1000 pb (figure 1). Deuxièmement, nous démontrons une puce PCR signaux suivants à partir du promoteur proximal de la croissance associée protéines-43 (GAP-43) que lors d'une lésion du nerf sciatique (couloir 4, la figure 2, 5 '). Aucun signal PCR est présent lorsque l'animal reçoit une blessure au simulacre seulement (piste 3), et lors de l'utilisation normale des IgG sériques pour la propriété intellectuelle (piste 5 et 6). Pour tester la spécificité de l'anticorps, nous avons analysé les échantillons d'ADN identiques, mais a utilisé un ensemble d'amorces de contrôle qui détecte une région dans le 3'-UTR de notre gène d'intérêt où aucune occupation est attendue. Signaux de PCR sont absents de toutes les voies (voies 3-6, Figure 2, 3 '), sauf pour le signal d'entrée, ce qui représente des échantillons d'ADN non-IP comme standard de contrôle PCR (voies 1-2, Figure 2). Cette procédure peut être effectuée ChIP suivants soit des lésions de la colonne dorsale sciatique ou épinière telles que résumées dans un schéma (figure 3).
Figure 1. Gel d'agarose des inversé réticulé ADN qui a été cisaillé par sonication à la bonne plage de longueurs de fragment.
Figure 2. Semi-quantitative des résultats de PCR à partir de tissus DRG suivants lésion du nerf sciatique montrant que p53 acétylée se lie à la région de GAP-43 promoteur proximal 48 heures après une lésion du nerf sciatique. Contrôle de PCR de l'émission des tissus DRG mêmes que p53 acétylés ne pas se lier à une région de contrôle de l'ADN située dans la région 3 'non traduite (UTR) du gène GAP-43 (S = Sham, I = blessé).
Figure 3. Un schéma général montrant la localisation des sites de lésion sur le nerf sciatique, et la colonne dorsale.
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Discussion
Ce protocole fournit une méthode pour poser directement sur l'environnement chromatine lors de la régénération axonale dans le système nerveux adulte après une lésion axonale. Il intègre le modèle de blessures avec des DRG immunoprécipitation de la chromatine à sonder l'environnement et épigénétiques de la transcription à la suite de blessures ni à la SNP ou SNC. Il est particulièrement utile pour les enquêteurs qui voudraient caractériser les sites putatifs de liaison pour le facteur de transcription de leurs préférés, et de déterminer si le taux d'occupation de ces sites se produit en réponse à une blessure. Modification épigénétique des histones et l'ADN de ces sites peuvent également être surveillés simultanément. Un protocole similaire peut être effectuée après une lésion du nerf facial, où les noyaux du nerf facial peut être disséqué par le tronc cérébral et traitées par puce comme nous l'avons déjà signalé (Tedeschi et al., 2009).
Comme il est typique pour les essais d'immunoprécipitation de la chromatine, deux étapes essentielles dans le protocole sont (1), la fragmentation efficace et la solubilisation des complexes ADN-protéines, et (2) la disponibilité d'un anticorps immuno bon pour votre protéine d'intérêt. Une limitation qui pourrait confondre ces deux étapes est le faible niveau de matériau de départ. Comparé à d'autres structures comme le cerveau ou la moelle épinière, DRG fournir une quantité relativement faible de tissus. En outre, les DRG se compose d'un mélange de la population des neurones ainsi que les cellules gliales, qui pourrait avoir des environnements différents chromatine. Cela peut conduire à des signaux IP hétérogènes, mais cette mise en garde est présent dans la plupart des échantillons prélevés dans le système nerveux. Une solution potentielle est d'effectuer puce après fluorescentes cellulaire activé le tri des neurones marqués par fluorescence transgénique DRG, (voir par exemple YFP-H souris, Bogdan et al., 2004), ou immuno-isolement des neurones par l'intermédiaire des billes magnétiques (Lee et al. , 2005). Cependant, ces deux approches doivent être validés pour CHIP dans les GHM et devra probablement une plus grande quantité de matériel de départ.
Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour identifier les sites de liaison pour plusieurs facteurs de transcription et de coactivateurs au promoteur des gènes de régénération connus associés, et nous avons utilisé à la fois semi-quantitatives et quantitatives des méthodes de PCR pour détecter l'ADN immunoprécipitée. Un ajout futur de ce protocole pourrait être l'utilisation de puces à tuiles suivantes ChIP (ChIP-on-chip), comme moyen de détecter le signal d'ADN finale. ChIP-on-chip augmenterait considérablement le nombre de sites de transcription identifiés via une approche impartiale haute débit. Elle pourrait aussi permettre l'étude de la façon dont deux ou plusieurs facteurs de transcription pourraient interagir sur une collaboration au niveau génomique.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Andrea Tedeschi pour les aider à mettre les expériences de ChIP initiales en laboratoire et Ricco Lindner pour sa contribution à affiner les conditions de ChIP. Ce travail a été soutenu par la Fondation Hertie, la subvention de Fortune, Université de Tübingen, et la DFG DI subventions 1497/1-1 (tous accordés à Simone Di Giovanni).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip Rack (8 well) | EMD Millipore | 20-400 | |
| Chloroform | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS Lysis Buffer | Upstate, Millipore | 20-163 |
References
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- Makwana, Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
