Summary

軸索損傷後の脊髄後根神経節の組織からのクロマチン免疫沈降

Published: July 20, 2011
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Summary

我々は、軸索損傷後の脊髄後根神経節の組織からクロマチン免疫沈降法を提示する。アプローチは、特定の転写因子結合部位と末梢および中枢神経系の両方で負傷した軸索の再生のための重要なヒストンとDNAのエピジェネティックな修飾を識別するために使用することができます。

Abstract

中枢神経系における軸索(CNS)、末梢神経系(PNS)のものは、損傷後の限られた範囲内で再生成しない状態が再生しない(総統 、2006)。それは、神経突起と軸索伸長に必須の転写プログラムはPNSの損傷(Makwana 、2005)により再活性化されていることが認識されている。しかし、in vivoでの神経細胞の遺伝子調節を分析するために利用できるツールは限られており、頻繁に挑戦です。

CNSとPNSの両方が同一の細胞体から発信された二股の軸索によって支配されているため、後根神経節(DRG)は、優秀な傷害のモデルシステムを提供しています。ガングリオンは、すべての転写のイベントが発生する細胞体の離散集合を表すため、容易にかつ再現性の動物から除去することができる転写活性の明確に定義された領域を提供します。軸索再生が発生しないPNS(例えば坐骨神経)、神経線維の損傷、再生が(例えば、脊髄を行われていないCNSにおける同様の傷害に応答するものとは異なる転写一連のプログラムを、明らかにすべき)。ヒストン、結合転写因子とPNSやCNSのいずれかに傷害に起因するDNA修飾のためのサイトは、クロマチン免疫沈降(チップ)を使用して特徴づけることができる。

ここでは、軸索損傷後の固定マウスのDRGの組織を使ってチッププロトコルについて説明します。この強力な組み合わせにより、軸索再生を促進するために必要なプロ再生クロマチン環境を特徴づけるための手段を提供します。

Protocol

1。坐骨&脊柱の神経損傷動物は、外科用タオルの上に置き、その下thermopadは37マウスの体温を維持℃までの手順全体を通して存在していますすべての動物は、連続的なO /イソフルラン2投与と手術用麻酔する。手術器具は、プロシージャの前にオートクレーブされています。 坐骨傷害の場合は、両方の後半部は慎重に剃毛され、そして脱毛前Betadyne 3回に続いて、アルコ…

Discussion

このプロトコルは、直接軸索損傷後の成人の神経系における軸索再生中にクロマチン環境について質問する方法を提供する。それはPNSやCNSのいずれかに傷害に続く転写とエピジェネティックな環境を調べるためにクロマチン免疫沈降法でDRG傷害モデルを搭載しています。それは自分の好きな転写因子のための推定結合部位を特徴づけるために、これらのサイトの占有率は傷害に反応して発生?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は微調整ChIPの条件への貢献のために研究室とリコリンドナーで最初のChIP実験のセットアップについて詳しくはアンドレアテデスキに感謝します。この作品は、Hertie財団によってサポートされていました。フォーチュングラント、チュービンゲン大学、およびDFG DI 1497/1-1の助成金を(すべてのシモーネディジョバンニに付与される)。

Materials

Reagent Company Catalogue number
10x ChIP Buffer Cell Signaling 7008
2x ChIP Elution Buffer Cell Signaling 7009
ChIP Grade Protein G Magnetic Beads Cell Signaling 9006
Magna Grip Rack (8 well) Millipore 20-400
Chloroform MERCK UN 1888
37% Formaldehyde ROTH CP10.1
10x Glycine Solution Cell Signaling 7005
Glycogen Sigma G1767
10x HBSS Gibco 14185
Histone H3 antibody (rabbit) Cell Signaling 2650
Normal Rabbit IgG Cell Signaling 2729
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol ROTH A156.1
Protease Inhibitors Cocktail Tablets Roche 04 693 116 001
Proteinase K (20 mg/ml) Cell Signaling 10012
SDS Lysis Buffer Upstate 20-163
Equipment needed
Sonicator
Micropestle
Microcentrifuge
Thermomixer

References

  1. Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
  2. Carey, M. F. . Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).
  3. Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
  4. Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
  5. Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
  6. Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
  7. Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
  8. Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
  9. Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).

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Cite This Article
Floriddia, E., Nguyen, T., Di Giovanni, S. Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury. J. Vis. Exp. (53), e2803, doi:10.3791/2803 (2011).

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