Summary

Kromatin Immunoprecipitation från dorsalrotsganglier vävnad efter axonal skada

Published: July 20, 2011
doi:

Summary

Vi presenterar en metod för kromatin immunoprecipitation från dorsalrotsganglier vävnad efter axonal skada. Den metod som kan användas för att identifiera specifika transkriptionsfaktor bindningsställen och epigenetiska modifiering av histon och DNA viktiga för regenerering av skadade axoner i både perifera och centrala nervsystemet.

Abstract

Axoner i det centrala nervsystemet (CNS) inte regenerera inte medan de i det perifera nervsystemet (PNS) inte regenerera i begränsad omfattning efter skada (Teng et al., 2006). Det är känt att transkriptionell program som krävs för neurite och axonutväxt är återaktiveras vid skada i PNS (Makwana et al., 2005). Men de verktyg som finns för att analysera neuronala genreglering in vivo är begränsade och ofta utmanande.

Dorsalrotsganglier (DRG) erbjuder ett utmärkt system skada modellen eftersom både CNS och PNS är innerveras av en tvåspetsnitar Axon har sitt ursprung från samma soma. Den ganglier representerar en diskret samling celler organ där alla transkriptionell händelser inträffar, och därmed ge en tydligt definierad region i transkriptionell aktivitet som kan enkelt och reproducerbart avlägsnas från djuret. Skada av nervtrådar i PNS (t.ex. ischiasnerven), där axonal regeneration sker skall avslöja en uppsättning transkriptionell program som skiljer sig från dem som svarar på en liknande skada i CNS, då regenerering inte sker (t.ex. ryggmärg ). Platser för transkriptionsfaktor bindande histon och DNA-modifiering som härrör från skada på antingen PNS eller CNS kan karakteriseras med hjälp av kromatin immunoprecipitation (chip).

Här beskriver vi ett ChIP protokoll med fixerat musen DRG efter axonal skada. Denna kraftfulla kombination ger ett medel för att karakterisera den pro-regeneration kromatin miljö som krävs för att främja axonal regeneration.

Protocol

1. Ischias och rygg kolumnen nervskada Djuret är placerad på en kirurgisk handduk och under den en thermopad är närvarande under hela förfarandet att hålla kroppstemperaturen på musen vid 37 ° C. Alla djur bedövas för kirurgi med ett kontinuerligt isofluran / O 2 förvaltningen. Kirurgiska instrument autoklaveras innan förfarandet. För ischiasnerven skada, är båda bakbenen omsorgsfullt rakad, och epilering avslutas med generisk hårborttagare före rengöring huden med alkoh…

Discussion

Detta protokoll ger en metod att direkt fråga om kromatinet miljön under axonal regeneration i den vuxna nervsystemet efter axonal skada. Den innehåller de DRG skada modellen med kromatin immunoprecipitation att utforska transkriptionell och epigenetiska miljö efter skada antingen PNS eller CNS. Det är särskilt användbart för utredarna som vill karaktärisera förmenta bindningsställen för sin favorit transkriptionsfaktor, och för att avgöra om beläggning av dessa platser sker som svar på skada. Epigenetis…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill tacka Andrea Tedeschi för hjälp med att den inledande ChIP experiment i laboratorium och Ricco Lindner för hans bidrag till att finjustera villkoren för Chip. Detta arbete stöddes av Hertie stiftelsen, Fortune Grant, universitetet i Tübingen, och DFG DI 1497/1-1 bidrag (alla beviljas Simone Di Giovanni).

Materials

Reagent Company Catalogue number
10x ChIP Buffer Cell Signaling 7008
2x ChIP Elution Buffer Cell Signaling 7009
ChIP Grade Protein G Magnetic Beads Cell Signaling 9006
Magna Grip Rack (8 well) Millipore 20-400
Chloroform MERCK UN 1888
37% Formaldehyde ROTH CP10.1
10x Glycine Solution Cell Signaling 7005
Glycogen Sigma G1767
10x HBSS Gibco 14185
Histone H3 antibody (rabbit) Cell Signaling 2650
Normal Rabbit IgG Cell Signaling 2729
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol ROTH A156.1
Protease Inhibitors Cocktail Tablets Roche 04 693 116 001
Proteinase K (20 mg/ml) Cell Signaling 10012
SDS Lysis Buffer Upstate 20-163
Equipment needed
Sonicator
Micropestle
Microcentrifuge
Thermomixer

References

  1. Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
  2. Carey, M. F. . Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).
  3. Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
  4. Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
  5. Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
  6. Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
  7. Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
  8. Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
  9. Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).

Play Video

Cite This Article
Floriddia, E., Nguyen, T., Di Giovanni, S. Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury. J. Vis. Exp. (53), e2803, doi:10.3791/2803 (2011).

View Video