Kromatin Immunoprecipitation från dorsalrotsganglier vävnad efter axonal skada
Summary
Vi presenterar en metod för kromatin immunoprecipitation från dorsalrotsganglier vävnad efter axonal skada. Den metod som kan användas för att identifiera specifika transkriptionsfaktor bindningsställen och epigenetiska modifiering av histon och DNA viktiga för regenerering av skadade axoner i både perifera och centrala nervsystemet.
Abstract
Axoner i det centrala nervsystemet (CNS) inte regenerera inte medan de i det perifera nervsystemet (PNS) inte regenerera i begränsad omfattning efter skada (Teng et al., 2006). Det är känt att transkriptionell program som krävs för neurite och axonutväxt är återaktiveras vid skada i PNS (Makwana et al., 2005). Men de verktyg som finns för att analysera neuronala genreglering in vivo är begränsade och ofta utmanande.
Dorsalrotsganglier (DRG) erbjuder ett utmärkt system skada modellen eftersom både CNS och PNS är innerveras av en tvåspetsnitar Axon har sitt ursprung från samma soma. Den ganglier representerar en diskret samling celler organ där alla transkriptionell händelser inträffar, och därmed ge en tydligt definierad region i transkriptionell aktivitet som kan enkelt och reproducerbart avlägsnas från djuret. Skada av nervtrådar i PNS (t.ex. ischiasnerven), där axonal regeneration sker skall avslöja en uppsättning transkriptionell program som skiljer sig från dem som svarar på en liknande skada i CNS, då regenerering inte sker (t.ex. ryggmärg ). Platser för transkriptionsfaktor bindande histon och DNA-modifiering som härrör från skada på antingen PNS eller CNS kan karakteriseras med hjälp av kromatin immunoprecipitation (chip).
Här beskriver vi ett ChIP protokoll med fixerat musen DRG efter axonal skada. Denna kraftfulla kombination ger ett medel för att karakterisera den pro-regeneration kromatin miljö som krävs för att främja axonal regeneration.
Protocol
Discussion
Detta protokoll ger en metod att direkt fråga om kromatinet miljön under axonal regeneration i den vuxna nervsystemet efter axonal skada. Den innehåller de DRG skada modellen med kromatin immunoprecipitation att utforska transkriptionell och epigenetiska miljö efter skada antingen PNS eller CNS. Det är särskilt användbart för utredarna som vill karaktärisera förmenta bindningsställen för sin favorit transkriptionsfaktor, och för att avgöra om beläggning av dessa platser sker som svar på skada. Epigenetis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Andrea Tedeschi för hjälp med att den inledande ChIP experiment i laboratorium och Ricco Lindner för hans bidrag till att finjustera villkoren för Chip. Detta arbete stöddes av Hertie stiftelsen, Fortune Grant, universitetet i Tübingen, och DFG DI 1497/1-1 bidrag (alla beviljas Simone Di Giovanni).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling | 7008 |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling | 7009 |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling | 9006 |
| Magna Grip Rack (8 well) | Millipore | 20-400 |
| Chloroform | MERCK | UN 1888 |
| 37% Formaldehyde | ROTH | CP10.1 |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling | 7005 |
| Glycogen | Sigma | G1767 |
| 10x HBSS | Gibco | 14185 |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling | 2650 |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling | 2729 |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | ROTH | A156.1 |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling | 10012 |
| SDS Lysis Buffer | Upstate | 20-163 |
| Equipment needed |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Microcentrifuge |
| Thermomixer |
References
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. . Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
